蛋白設計（Protein Design）是指通過計算機模擬和實驗方法來設計和創建具有特定功能的全新蛋白質。該領域結合了生物化學、計算生物學、分子生物學和生物工程等多學科的知識，旨在生成具有預期功能和穩定性的蛋白質，這些蛋白質可以在醫學、工業、農業等領域中發揮重要作用。
傳統的蛋白設計方法有計算機輔助設計（使用算法和模擬來預測蛋白質的三維結構和功能，常用的軟件包括Rosetta、Foldit等)、定向進化(通過隨機突變和篩選來選擇出具有所需功能的蛋白質，這種方法模擬了自然進化過程)、定點突變(通過改變蛋白質序列中的特定位點，觀察其對蛋白質結構和功能的影響)等等。
近年來，深度學習推動了蛋白質結構的預測和設計。擴散模型是一種生成式模擬方法，也適用於蛋白質設計。這類模型以前存在成功率不高的問題，產生的序列基本不能折疊成目標結構。
2023年，美國華盛頓大學的David Baker和同事的研究表明，通過細調之前的RoseTTAFold的結構預測網絡並將其整合到一個降噪擴散模型中，就能生成具有實際意義的蛋白質骨架，而蛋白質骨架決定了蛋白的形狀和功能。最新的RoseTTAFold Diffusion（RFdiffusion）方法能測試擁有不同結構元素的設計組合，並從頭開始產生蛋白質。該模型能執行不同的任務，設計單體、寡聚體和有治療或工業應用前景的複雜結構(如結合位點)。RFdiffusion能產生總長度達600個殘基的結構，複雜性和準確度都比之前更高。進一步改進該方法或能設計出複雜程度更高的新蛋白。
David Baker研究團隊使用RFdiffusion技術，設計了全新的蛋白質，能夠特異性地中和蛇毒中的致命毒素(David Baker, Susana Vazquez Torres, Melisa Benard Valle et al. De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins, 17 May 2024, PREPRINT (Version 1) available at Research Square [https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4402792/v1])。
相關背景知識: 蛇毒中的三指毒素（3FTxs）是一類高度致命的神經毒素，能夠引起嚴重的組織損傷和神經功能障礙。這類神經毒素能夠迅速引發一係列病理效應，包括肌肉癱瘓、呼吸衰竭和組織壞死。這些毒素通過與受害者體內的煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）結合，幹擾正常的神經傳導，導致生命威脅的神經毒性。
α-神經毒素是3FTX的一個重要亞類，采用多鏈β結構，其中三個延伸環從由高度保守的二硫鍵穩定的疏水性致密核心突出。短鏈和長鏈α-神經毒素的二硫鍵長度和數量不同。盡管序列同源性，α-神經毒素在nAChR亞型中顯示出不同的藥理學特征：短鏈和長鏈α-神經毒素抑製肌肉型nAChRs，但隻有長鏈α-神經毒素與神經元α7 nAChRs39強烈結合。
使用深度學習的方法設計蛋白來中和蛇毒:
采用RFdiffusion的方法，能夠創造出專門針對3FTxs的蛋白質，這些蛋白質具有高親和力和熱穩定性。下麵的概念圖(Figure 1d) 說明了RFdiffusion方法如何用於設計能夠與3FTxs特異性結合的蛋白質。這個過程涉及多個步驟，包括生成初始的蛋白質構型，並通過迭代優化來提高其與目標毒素的結合親和力。
Figure 1d. Schematic showing α-cobratoxin binder design using RFdiffusion. Starting from a random distribution of residues around the specified β-strands in the target toxin (dark purple), successive RFdiffusion denoising steps progressively remove the noise leading at the end of the trajectory to a folded structure interacting with α-cobratoxin β-strands.
蛋白的表征:
共有55種蛋白質設計在大腸杆菌中重組表達，SEC純化後，通過發光細胞活力測定中18種表達為單體形式。通過SPR確定來自Naja pallida的細胞毒素的KD為271 nM，CYTX蛋白CD光譜，熱穩定，Tm為61°C。
利用表達肌肉型nAChRs的人源性橫紋肌肉瘤細胞係為對象，進行膜片鉗研究以確定這些蛋白質的功能。對毒素 ScNt，設計的蛋白SHRT在與毒素1：1比例下，完全抑製毒素的活性；優於之前報道的針對毒素蛋白 ScNt的納米抗體(TPL1163_02_A01）。
這個例子顯示了RFdiffusion的潛力，能夠顯著加速蛋白質工程的研究進程，並在多領域產生深遠影響。
