我們研究生課程還有細胞生物學、電子顯微鏡技術、和組織化學染色。細胞生物學由生物學教研室和組織胚胎學教研室聯合授課,我印象深刻的是兩個實驗課,一是生物學教研室安排的染色體製作,全班同學製作的是我的染色體。實驗前我前去生物教研室獻血,隨後的白細胞分離過程我沒有參與,老師介紹說要培養我的白細胞,並加入秋水仙素阻止細胞分裂時紡錘絲的形成,這樣染色體就不會被分離到細胞的兩端,細胞就不能分裂成兩個子細胞,所有細胞都處於這個階段。實驗課時,我們要將細胞離心,加入低滲溶液,使細胞脹大,再用吸管吸取細胞懸液,讓細胞懸液高高地滴落到玻片上,把脹大的細胞摔碎,再用吉姆薩染液將染色體染成藍色,在顯微鏡下觀察。老天長眼,我自己製作的染色體最清晰,視野幹淨漂亮,染色單體都看得清清楚楚,封片後就可以永久保存。實驗老師答應幫我封片後返給我,不過玻片並沒有回到我手裏,我的染色體標本“散落民間了”。
另一個實驗是在組織胚胎學教研室進行,但我們主要是觀察,因為要接觸放射性元素,實驗名稱也被叫做“放射自顯影”,用的最多的是mRNA檢測,其實就是雜交反應。製作一帶有放射性的探針,該探針就是一小段核酸片段,隻特異性地與某一特定基因mRNA雜交,沒雜交上的就被洗掉了,雜交上的探針帶有的放射性可使X光片曝光成黑色。這個實驗最終失敗了,我們什麽也沒有看到,隻是學會了個基本原理。失敗的原因也說不清楚是在哪一步上出的問題,因為這個過程太長,前後拖了兩周時間。檢測基因片段mRNA的雜交曝光顯色叫做Northern blotting, 檢測DNA上基因片段的叫做Southern Blotting,檢測探針都是一小片核算片段。相反,檢測蛋白質的探針則是待測蛋白的抗體,隻對應地與其抗原,就是待測蛋白質結合,形成抗原抗體複合物,這個檢測方法叫免疫雜交,也叫Western Blotting。現在是東西南北三缺一。
電子顯微鏡技術和組織化學都是由組織胚胎學教研室獨立授課。電鏡技術主要是學習電鏡標本的收集、固定、樹脂包埋處理、玻璃刀切片等等一係列的技術,但在實驗前,許廣源教授給我們講了照相的原理,問我們知不知道什麽叫“景深”,沒人舉手,許老師笑了笑說,不知道什麽是景深,照相就是瞎胡鬧,隨後解釋什麽是景深。懵懵懂懂地,我把它與電視劇《上海灘》聯係起來了。看《上海灘》馮敬堯的特寫鏡頭時,屏幕上隻是他的一個大腦袋,他後麵的人影都是虛的,那是因為拍攝的鏡頭景深不夠唄!
組織化學實用性很強。組化要保持組織活性,所以要用冰凍切片,使酶仍然保持活性。設計的方法要使反應產物不溶於水,形成沉澱顆粒,這樣就不但可以檢測酶活性,還可以在顯微鏡下定位。我的畢業論文裏有一個實驗就是采用了組化技術檢測腎髒一氧化氮合酶的活性和分布,發現該酶隻位於腎皮質而不在腎髓質。一氧化氮合酶催化一氧化氮的產生,一氧化氮有很多生物學作用,大家熟知的是擴血管作用,用於心髒冠狀動脈血管的擴張治療心絞痛(硝酸甘油),或者陰莖動脈擴張促進陰莖勃起(偉哥)。我檢測它的目的不是看它是否引起“腎髒勃起”,而是看它與腎髒毒性的關係。
在做畢業論文前,我是在大連醫科大學-日中永和協會合作醫藥科學研究所打工實習賺外快,因為當時的所長是我的導師仲來福教授。仲老師知道我是來自“窮鄉僻壤”的一個“負翁”,窮困潦倒,需要幫助,就讓我參與研究所藥物開發研究,這樣我就可以從研究所領取勞務補貼。前文提到的72隻大鼠就是為研究所做的第一個實驗。
關於日中永和協會,網友馮墟曾做過介紹。其實在該研究所成立前,是以一個研究室的形式存在的,第一任主任是個病理學教授,名字好像叫王均連,不肯定,因為沒見過,也不熟悉這個老師。後來的主任是生化教授崔肇春,崔老師給我們研究生上過高級生化課,他講授細胞信息傳遞有關內容。崔老師知識淵博,英文也好,大醫生化博士點是以崔老師作為博士生導師申請的,據說因為出身問題,崔老師比別人當了更多年的助教。當時研究室開始開發研究抗癌新藥YS2H,該藥是從經X光照射後發酵的牛肝裏提取的脂質物質,所以最初就取名叫“牛肝脂”,後來崔老師將其起了個英文名叫Heplipin,中文意譯為“肝脂素”,音譯為“和普利平”。該藥的發明者是日本岡山大學病理學副教授林肇輝。林先生不是來自日本本土四島,可能來自琉球一帶,當時人們認為,他是在岡山大學升遷無望的情況下才一門心思紮入該藥的開發研究上的。在他力主下,成立了大連醫科大學-日中永和協會合作醫藥科學研究所。給研究所掛橫幅時,有人故意把“日中永和協會”寫成“中日永和協會”,結果被林先生給糾正過來了。林先生親自挑選仲老師任所長,他認為仲老師是個毒理學家,與藥物研究相通,另外在他眼裏仲老師紮實肯幹。他找仲老師談了幾次,仲老師才答應了他的請求。仲老師當時熱衷於學術研究,對於藥物開發興趣不濃,另外據仲老師後來講,他拒絕是因為覺得有壓力,這是一個國際合作項目,已經幹了幾年,也沒有看到什麽前景,他擔心被自己搞砸了。後來證實,林先生眼光獨到,仲老師帶領大家最後將該藥開發成功。
我研究生剛入學時仲老師還沒有就任所長,等我進科時仲老師就是所長了,辦公室從一樓搬到了六樓,所長辦公室也兼做會議室,寬敞明亮,可以直接看到海,旁邊一個小小的辦公室則是林先生和林太太的。再向裏邊則是南北通透整個貫通的實驗室,條件在當時已經是非常好了。在我研究生麵試時,教研室是在舊樓,入學後教研室就搬進了新樓。新樓啟用沒有幾年,大醫就又搬走了,看來大醫是個搬遷癮君子!新址在大連與旅順之間,位於旅順南路南側,就在海邊。旅順南路的北側是一同搬遷來的大連外國語學院。
林太太是台灣人,中日文都流利,需要時兼做林先生的翻譯,仲老師曾評價說她有兩套思維。林先生也兼任我們研究生的導師,因為他是病理學家,我們的形態學研究都由他來指導,他的英文很好,盡管口音較重。他主要的研究方向是血液病理,以他的觀點,血液學研究可以在血液病人身上做到診斷、治療、科研一起上,因為對病人抽血和抽骨髓是常規,很少需要動物實驗。林先生有一項很玄乎的研究,就是觀察血液裏的P細胞(也不知是誰命名的)與精神分裂症之間的關係。由副校長升任校長的薑潮是流行病學導師,但他的專長是心理學,曾在當地電台主持過午夜心理谘詢節目,所以他的研究生就跟隨林先生做P細胞與精神狀態的研究。林先生為人隨和,有一年夏天閑聊時聽說我是一個孩子的父親,第二天就帶來一個小遊泳圈,用生硬的中文說:“給-你的-小孩!”
作為大連醫科大學的客座教授,林先生還為大醫牽線與別的日本團體合作。他有個好朋友叫堀井鬱夫,(“堀井”在中文念“枯井”而不是“掘井”,盡管日語意思就是“掘井”),在日本羅氏研究所任臨床前開發部主任。林先生介紹堀井先生到大醫講座,後來促成大醫與日本羅氏合作,我因而被大醫派往日本羅氏學習半年,不過這已經是我畢業留校以後的事了。在日本羅氏聽說林先生當年是拿著腐爛的肝 (可能是發酵過的)去找堀井先生的。還聽說林先生的抗癌新藥YS2H是四個人的姓氏的第一個字母合在一起,這兩個H,一個是他自己Hayashi,另一個是堀井先生Horii,至於YS是哪兩個人因為我不熟悉這倆人也沒聽懂就沒有記住。日本羅氏當年是Roche藥廠在亞洲唯一的一個研究所,位於橫濱附近的神奈川縣鐮倉市,後來與另外一家日本藥廠Chugai合並,堀井先生則跳槽到位於名古屋的日本輝瑞。
和普利平最核心的藥效成分被認為是脂肪酸的混合物,牛肝發酵後脂肪酸種類大幅增加,但X光照射則影響不大,後來就取消了這一步。氣相色譜分析發現它含有三十多種脂肪酸,做色譜分析的滿老師說他從來沒見過一個樣品裏含有這麽多種類的脂肪酸。當時的牛肝由內蒙古通遼市一家單位提供。做抗癌藥效試驗時,交給我的任務就是做一個它對化學誘導癌的預防作用,可以兼做我的研究生課題。這種實驗耗時長,一旦失敗,我都沒有時間補救,所以有的人勸我不要把這個作為研究生課題,但我又不好推脫,畢竟我是領取勞務費的。我查了一些英語文獻,發現大部分都是研究脂肪酸對結腸癌的預防,我也就照貓畫虎地建議做結腸癌,其誘導劑是二甲基肼。後來因為二甲基肼購買遇到困難,結果作罷。但後來仲老師跟我講,“結腸癌選的好啊!”原因是有一個結腸癌患者主動要求試用和普利平,結果腫瘤變小了。當時林先生有一個想法,就是不要把癌腫全消除,因為這樣需要大劑量的化療藥,副作用太大,而用小劑量則副作用小,但能抑製腫瘤進一步增大和轉移,所以林先生主張讓人與小號的腫瘤共處。
我參與了和普利平抗癌藥效的動物學試驗,每批都是上百隻小鼠,接種癌細胞後每天經口灌胃給藥,比起給大鼠灌藥要簡單得多。記得第一次練習給大鼠灌胃時,仲老師囑咐我說,如果大鼠拚命掙紮,或者我自己不小心被咬了,“不要跟它們一般見識”,不要粗暴對待動物,一定要設法讓它們溫順。後來仲老師給研究所裏所有的研究生演示給大鼠灌胃,林先生則演示經眼睛眶下靜脈叢取血和經陰莖背動脈注射給藥。除動物實驗外,我用癌細胞株做了一個所謂的機製研究,當時細胞凋亡研究比較時髦,我就檢測和普利平是否誘導癌細胞凋亡,結果還真是能誘導凋亡。開發藥物要能用現代醫學解釋清楚其機製,用仲老師的話說就是往哪個機理上“賴”。據說當年中藥雄黃(三氧化二砷)治療白血病就是因為發現它能誘導癌細胞凋亡而被國際承認。
對和普利平的開發還是很辛苦的,首先它的藥劑很難過關,因為是脂類混合物,很難進一步純化或製成結晶體,總是黏糊糊的,需要製成混懸液,長期動物腹腔注射造成髒器粘連,肝髒腫大,最後不得不經口給藥。大部分的抗癌藥都是注射給藥,藥效好,但毒性大。和普利平經口的毒性小,但藥效也沒那麽強。當時臨床前審批要求是要對至少三種腫瘤細胞的體內抗癌有效,結果到處搜羅不同的癌細胞株來試,好不容易試出三個來。仲老師當時評價說:“YS2H,YS2H,聽起來都煩,全是骨頭,沒有肉。” 不過,對我個人來說,我得到了鍛煉,我的各種動物實驗技術也從中得到很大提高。林先生經常給仲老師畫大餅,說做完YS2H後,他可以聯係別的項目來大醫做。仲老師說我們現在就可以做,林先生趕緊說:“YS2H”,意即現在隻能做YS2H。研究所後來確實又做了好幾個項目,我也參與其中,但不知是否是林先生牽線搭橋的。
和普利平首先被大連市藥監局批準在大連市範圍內進行臨床試驗。後來到北京國家藥監局參加審批會議,我們所有人都參加了。我的一個師兄看著這破破爛爛的院子,疑惑地問:“就在這兒開會?”陪同我們一起去的遼寧省藥監局主任說:“嗯,這地方,水兒深呐!”隨後安慰我們說:“沒問題,這藥安全、有效,怎麽能不通過呢?”果然最終通過了。林先生回日本後,繼續兜售和普利平,但在日本沒有批文,用仲老師的話說他就是在賣假藥。他被逮捕,據說主要是因為他太倔強,當局幾次勸告不聽,他認為他是在幫助病人。林先生被逮捕後,林太太聯係大醫和仲老師,請求寫一些證明材料並在一些文件上簽字,後來我出國離開大醫,最後詳情不太了解,恍惚印象是林先生最後被罰款然後釋放。