新型冠狀病毒核酸檢測陽性率低和速度慢的原因分析和對策(修改稿1）
作者：柳涯客
目前，新型冠狀病毒的疫情仍然十分嚴重，截至2月14日，中國確診病例63936，疑似病例10109，死亡1381例, 治愈6864例 。前湖北省委書記蔣超良2月8日曾要求：“兩天內檢測完武漢所有疑似患者”。而工程院的副院長、中國醫學科學院院長王辰院士接受央視《新聞1+1》采訪時披露：“目前核酸檢測的陽性率隻有30-50%”。也就是說，同一個臨床疑似肺炎病人，平均檢測2-3次或以上才有一次陽性結果。
據我了解，現時武漢的日均核酸檢測能力約為7000/天。從疫情公布以來，確診病例每日攀升，疑似病例數仍有1萬多例。隨著全國各地陸續複工，病毒檢測的任務會更加繁重。有沒有可能兩天內檢測完武漢所有疑似患者？完全可能，但我們需要改進核酸檢測的技術和方法。
- 核酸檢測的主要問題是陽性率低和檢測速度跟不上。我認為陽性率低的主要原因是取樣和病灶距離有點遠。新冠病毒的易感病灶是下呼吸道(氣管、主支氣管)和肺。現在取樣主要在上呼吸道(鼻、咽、喉)。雖然肺泡灌洗液檢測的陽性率最高，但有創，費時和技術要求高而無法推廣。新型冠狀病毒感染者以幹咳為主，痰少又取不到樣, 所以咽拭子是我們目前取樣的主體。
- 病毒核酸檢測包括取樣，核酸提取和RT-定量PCR三個主要步驟。我們需要成立科技攻關小組，做多方麵的嚐試，攻克核酸檢測的技術和方法的限製，在近期集中解決取樣中病毒核酸的數量和質量不夠理想的問題, 我的分析和對策是：
1. 改進取樣和處理方式, 提高病毒核酸數量和質量
1）咽拭子采用標準3個拭子3位置點取樣
最敏感的核酸檢測實時（定量）RT-PCR方法大概隻能檢出5個病毒以上的感染。取樣病毒數量少是核酸檢測的陽性率低的關鍵原因之一。咽拭子說白了就是護士拿棉簽刮一下咽部送檢。另外病程的時間段（早期，中期和危重期), 刮取的位置和手法個人不同也是導致30-50%陽性率的原因。提高檢出率的核心在於首先提高取樣病毒數量。
如果采用標準取樣點，固定3個拭子取樣的位置在咽部9點，12點位和3 點位，可以避免護士刮取位置和手法不同所造成的采樣差異。3拭子合並送檢可能增加取樣病毒數量3倍，從而提高陽性率。
2）采用兩個鼻拭子取樣
建議病人做鼻拭子取樣, 有證據表明鼻拭子的陽性率好於咽拭子。如果驗證明確的話所有咽拭子都可以被鼻拭子取代。對於難檢病人甚至可以考慮咽拭子和鼻拭子合並送檢的方法。
3）取樣途徑多種化, 院外首次檢測陰性病人和住院病人增加血檢
雖然血液細胞不是病毒最易感的細胞，但全身器官中肺部耗氧最多(超過心和腦)。肺的血液供應非常豐富而且血液中有豐富的免疫淋巴細胞。因此，如果新型冠狀病毒感染到肺，收集病人的血做核酸檢測就十分合理。
建議院外首次檢測陰性病人和住院肺炎病人抽取5-10毫升血液送檢。住院病人抽取的血樣可以一半做核酸檢測，一半做抗體檢測。此外，輕症病人自己取樣洗鼻液, 漱口液也可以考慮。洗鼻的方法如同過敏性鼻炎的洗鼻。
鼻拭子和咽拭子少量洗脫液直接變性以及血清變性後離心直接做RT-PCR也可一試。
4) 改進提取RNA的方式
2020年1月24日Huang C等發表在Lancet的文章中用了住院肺炎病人的血做核酸檢測，陽性率為15%。是不是不值得提倡？在我看來，他們的方法可以改進，例如加大血的用量（從80微升加大為240微升甚至更多），減少最後洗脫溶液（50微升變為10微升），這樣的改進可以提高病毒數量15倍(見附1)。即使仍然是15%陽性率，依然可以作為其他方法的補充。
5）避免運輸和待檢過程中降解以保證提取核酸的質量
另一方麵，增加核酸檢測的陽性率需要提高提取的病毒核酸質量。由於降解核酸的酶特別頑固。平常滅菌采用蒸汽100度消毒5～10分鍾或烤箱消毒120度消毒15～20分鍾就可以。滅活核酸酶需要300度2小時。所以操作需要十分小心，一不留意，核酸就降解了。武漢大學人民醫院檢驗科主任李豔介紹: “我們一開始先把病毒滅活，56度45分鍾把它滅活完了以後，沒有活性了我們再來做核酸的檢測”。我覺得這種方式比較危險，因為1）人體體液富含核酸酶; 2) 核酸酶起作用的最佳溫度也是60度, 非常接近56度, 所以一定慎用不加變性劑條件下56度加熱45分鍾的滅活方式。
運輸和待檢過程長達數小時至2天，期間的病毒RNA降解也是需要考慮的因素。美國CDC要求48小時內檢測的樣品保存在4度，超過48小時就冷凍。我的一個改進對策是：采樣和加病毒裂解液滅活由護士或護工進行，然後密封常溫運輸至檢測室，加滅活劑後能防止病毒RNA降解。
6) 檢測試劑盒 (核酸和抗體檢測比較)
根據美國CDC關於SARS實驗室檢測的一些經驗，血液以外的樣品較敏感的還是實時RT-PCR為基礎的核酸檢測試劑盒為好，在合適的時間段內檢測血液抗體也不錯。感染一周內抗體尚未出現，血液檢測抗體效果不佳。臨床症狀出現3周後的病人血液核酸檢測反而不如抗體檢測敏感。
另外，美國CDC要求核酸檢測試劑盒內一定要有3個對照：陽性，陰性和核酸質控對照, 否則影響檢測效果的評價。
2. 提高新型冠狀病毒核酸檢測速度
武漢的日均核酸檢測能力為7000/天, 限速環節主要在核酸提取, 改進對策有這幾個方麵：
1）操作安全等級和放權
新型冠狀病毒在中國定為乙類甲管，即“乙類傳染病按照甲類傳染病的預防控製措施進行管理”。但是預防控製可以按照甲類，核酸檢測應按乙類。美國FDA2月4日前，所有的新型冠狀病毒核酸檢測都要求送到美國疾控中心（CDC）檢測，等待時間為2-5天。FDA2月4日緊急下放新型冠狀病毒檢測權限到各地區CDC核準授權實驗室，加快了檢測進程。隻是美國隻有15例感染者，沒有太大的檢測需求。我個人認為病毒滅活後的操作也可以考慮在P2+的實驗室做。
2) 如有必要成立集中檢測室提高檢測通量
病毒滅活後密封常溫運輸至“雲神山檢測室”進行核酸提取。雲神山檢測室是我起的名字，大概可以容納100個檢驗員，每個人8小時可以提取200個樣品的核酸。集中能提高機器的使用效率並提高檢測通量。
3）檢驗員人數
找不到足夠檢驗員怎麽辦，武漢有60多家醫院，每個醫院抽2個人就是120人。全國已支援1萬多醫務人員，增加支援100個檢驗員應該可行。另一個選擇則是招募100個生物研究生或醫學本科生（上過生物實驗課），培訓一天就可以勝任。
4）檢測機器數量
2個檢驗員和一台實時（定量）PCR機器8小時大概能人工檢測8板近1000個樣品(384孔/板接近120樣品/板), 140個檢驗員20台機器一天就可以人工檢測2萬個樣品。
5) 改進核酸提取方法
核酸提取方法也需要改進，基於Huang C博士和Zymo公司方法我簡化了一些過程並增加了普適性(附1)。病毒滅活劑(TRIZOL)的主要成分是苯酚。苯酚的作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白變性，釋放核酸物質。由於苯酚不能完全抑製RNA酶活性，TRIZOL中還加了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、貝塔巰基乙醇來抑製內源和外源RNA酶。
以上是我的關於提高陽性檢出率和檢測速度的分析和對策，希望轉告有關人員。大疫當前，人應不分海內外群策群力共克時艱。如果這些建議有所幫助, 也是我們大洋彼岸華人科學家為早日結束新型冠狀病毒肆虐作出的一份貢獻。
2020年2月14日
附1.微量總 RNA 提取方法(另需TRIZOL裂解試劑)
試劑盒組成:
洗滌液 1, 第一次使用前按說明加指定量乙醇 (無水乙醇, 95-100%）;
RNA 洗滌液 2, 第一次使用前按說明加指定量乙醇;
RNase-free H2O 室溫 6 ml; 1 號柱, 收集管（2ml）
特性:
1. 樣品來源：TRIZOL等類似試劑裂解的混合樣品。
2. 樣品範圍：≥17核苷酸。
3. RNA結合量：每個柱子可最多結合10μg的RNA。
操作步驟:
以下離心如無特殊說明均在10,000-16,000 x g範圍內離心1分鍾。
（I） 樣品裂解勻漿（混勻後靜置5-10分鍾）
1) 全血樣品：直接取1體積的液體樣品，加入3 倍體積裂解液（推薦240μl全血加入720μl裂解液），充分振蕩並且混勻。
2) 洗鼻液，漱口液離心2分鍾 (1000RCF/分)棄上清，細胞沉澱加300μl TRIZOL裂解液（或拭子洗脫液加入3 倍體積裂解液），充分振蕩並且混勻。
（II）樣品純化：
1. 加入等體積(95-100%)的無水乙醇到上一步TRIZOL裂解液中混勻。
2. 一次或重複幾次將上述混合物放入套在收集管內的1號柱裏，離心1分鍾，去除濾出液。
3. 添加400μl的RNA洗滌液2到1號柱裏，離心1分鍾，去除濾出液。
4. 添加400μl的RNA洗滌液1到1號柱子裏，離心1分鍾，去除濾出液。
5. 添加700μl的RNA洗滌液2到1號柱子裏，離心2分鍾以免洗滌液殘留。
6. 取出1號柱，放入一個無RNA酶的離心管中，在吸附膜的中間部位加10-15μl RNase-free
water，室溫放置2分鍾，離心1分鍾洗脫RNA。
注：此方法根據Huang C等論文(Lancet,Jan 24，2020) 和Zymo公司方法改編
