端粒和端粒酶的發現曆程 by Toptip

（作者toptip注明：本文是基於個人理解來整理的端粒和端粒酶的發現曆史，因為知識時間有限，
其中必有偏差和謬誤的地方，關鍵之處還是以原始文獻為主。本人之所以趕這趟諾貝爾獎熱，
花大量的時間進行文獻閱讀和整理，是因為它提供了一次極好的向公眾傳播科學思想的機會。
由於端粒和端粒酶領域的一係列發現貫穿著“發現現象/問題”-“提出概念/模型”-“實驗驗證”的思路，
重現這個思路對科學工作者是有啟發意義的。本文也提供了一個很好的教學案例。物當盡其用，歡迎轉載傳播。）

 

究竟是重組還是全新的酶？為了厘清這兩個假說，Liz意識到最重要的是找到這個“酶”。如前所述，
在四膜蟲接合細胞的大核發育過程中，大核產生了非常豐富的染色體，每一個小染色體都被從頭加上了端粒。
可以推測，如果“酶”的假說成立，此時細胞內的“酶”活性應該是非常高的。1984年，Carol女士作為博士生加盟了Liz實驗室。
她們倆精心討論設計實驗，用四膜蟲的核抽提液與體外的端粒DNA進行溫育，試圖在體外檢測到這個“酶”活性，
看到端粒的延伸。經過不斷優化條件，尤其是把底物換成體外合成的高濃度的端粒DNA後，同年的聖誕節，
勤奮的Carol同學打開暗盒曝光x光片，終於清楚地看到了“酶“活性。在測序膠的同位素曝光片上，
端粒底物明顯被從新加上了DNA堿基，而且每六個堿基形成一條很深的帶，與四膜蟲端粒重複基本單位為六個堿基正好吻合[8]。
這種酶活性不依賴於模板，隻對四膜蟲和酵母的端粒DNA進行延伸，而對隨機序列的DNA底物不延伸；
並且該活性不依賴於DNA聚合酶[8]。由於同源重組對序列沒有特異性的要求並且依賴於DNA聚合酶的活性，
至此，她們澄清了這兩種假說，證明了有一種“酶”來延伸端粒DNA。這種酶後來被命名為“端粒酶”（telomerase）。

端粒酶RNA亞基的發現

緊接著她們對端粒酶活性進一步定性。此時Tom Cech（因為發現RNA可以有酶活性獲得諾獎）正好訪問Liz的實驗室，
她/他們一起做了個簡單的實驗，就是用RNA酶處理樣品，降解樣品的RNA，看看端粒酶活性是否受到影響。
結果是酶活性竟然消失了，端粒酶活性依賴於RNA[9, 10] 。端粒酶會不會是另外一種特殊的RNA酶？
想必從這個時候，Tom Cech 開始被端粒酶深深吸引，並介入了這個領域。當然那時候也知道端粒酶是依賴於蛋白的：
用蛋白酶消化後的樣品也不具備端粒酶活性[8]。1989年，Carol通過跟蹤端粒酶活性，用柱子純化並克隆了四膜
蟲的端粒酶RNA亞基。另一個謎底揭開了：RNA亞基有一段RNA序列正好和四膜蟲的端粒DNA序列互補，
端粒酶正是利用RNA亞基的這段序列作為模板重複複製出端粒DNA[11]。

端粒和端粒酶領域的領軍人物多數是女士。公平起見，不妨多介紹幾位。Virginia Zakian女士的實驗室發現端粒區域具有TPE效應
（Telomere Position Effect，端粒位置效應），也就是置入端粒區域的基因會被silenced（沉默），
不表達。我們來看看Daniel Gottschling實驗室是如何利用TPE現象來設計實驗，篩選出酵母的RNA亞基基因的，
同時也見識一下酵母這個非常強大的遺傳學模式生物。

首先把URA和ADE兩個基因通過遺傳重組的方法置入端粒區域。URA基因使酵母能夠自己合成uracil（尿嘧啶），
但是該基因能夠將化學物質FOA轉化成有毒的物質，從而使酵母不能夠在含有FOA的平板上生長；
缺少ADE基因則會讓酵母累積紅色素，使酵母克隆變成紅色。由於端粒的TPE效應，URA和ADE被silenced，
酵母隻能在含有uracil的培養基中生長，能在FOA平板上生長，且克隆是紅色，。在這個遺傳改造過的酵母中轉入酵母的
cDNA表達庫，可以預計，某些調控端粒長度的基因通過過表達可以改變端粒的長度。如果端粒長度變得足夠短的話，
TPE效應就會消失，URA和ADE兩個基因就會啟動表達。那麽這種短端粒的酵母就能夠在不含有uracil的培養基中生長，
不能在FOA平板上生長，並且酵母克隆顯示出紅色。用這三個指標進行篩選，可以篩選到一係列影響端粒長度的基因。
其中一個基因比較特殊，任何閱讀框都隻能閱讀一小段蛋白序列，看起來更象個RNA基因。深入研究發現這個基因
含有酵母端粒序列的互補序列，而且對這一序列進行突變，酵母的端粒序列也發生相應的改變-這個基因
正是編碼酵母端粒酶RNA亞基的基因[12]。這個發現有運氣的成分，因為一般情況下，端粒酶正調控基因過表達，
端粒應該變長才對。但是恰恰相反，酵母RNA亞基的過表達，端粒反而變得很短。此後的1995年，
同樣是Liz實驗室報道了酵母端粒酶的活性[13]。

端粒酶催化亞基的發現

到RNA亞基被揭示為止，謎團就隻剩下端粒酶的蛋白質亞基了。端粒酶既然能夠利用RNA模板亞基來複製DNA，
那麽很容易推測這個蛋白亞基可能具有RNA dependent DNA polymerase活性（依賴於RNA的DNA聚合酶活性），
也就是逆轉錄酶的活性。更進一步地說，它的蛋白序列裏應該包含逆轉錄酶特有的結構域。盡管沒有實驗證據，
這個謎底已經猜到了一半，很多人都想徹底地揭開它，不同實驗室的競爭也變得激烈起來。

1989年，端粒與端粒酶領域的另外一位女傑，Jack Szostak實驗室的Vicki Lundblad利用設計精巧的遺傳學篩選方法
從酵母中篩選到了EST1基因（這個遺傳學方法描述起來比Daniel Gottschling的更為複雜，這裏就不多介紹了，
有興趣的去讀原始文獻）。敲除EST1基因，端粒會隨著酵母的傳代逐漸縮短，最後縮短到一定程度的時候，
酵母就衰老死亡[14]。

Est1蛋白從酵母的表型看來很像是端粒酶的蛋白催化亞基。Vicki Lundbrad和Liz在90年的Cell雜誌上大膽猜測
Est1蛋白含有逆轉錄酶的結構域[15]。Virginia Zakian實驗室在95年的cell上也報道Est1蛋白是酵母端粒酶的體外
活性所必需的[16]。不過發表在頂尖雜誌的工作並不一定是好工作，科學也有謬誤的時候，尤其是在競爭激烈，
人們已經感覺得接近於揭開謎底的時候容易急躁，匆忙發表了一些不夠solid（可靠）的數據。
這一次運氣不站在她們一邊，謎底猜錯了。

那麽端粒酶的催化亞基是什麽呢？1996年，Tom Cech實驗室用生化的手段純化了四膜蟲端粒酶複合體，
其中有一個蛋白根據分子量命名為p123 [17]。同一時期，Vicki Lundblad實驗室改進了她的遺傳學篩選方法，
篩選到了幾個與酵母端粒複製密切相關的基因，命名為EST2，EST3和EST4（也叫CDC13）[18]。
這個改進版的篩選方法非常厲害，它把酵母端粒酶全酶的亞基一網打盡。值得一提的是盡管這個結果
隻發表在“影響因子”不太高的Genetics（遺傳學）上，它的影響卻非常深遠，此後很長一段時間乃至到現在，
酵母端粒和端粒酶的研究都集中在闡述這幾個基因的功能上。

用生化方法純化出來的四膜蟲p123蛋白，以及用遺傳學方法篩選出來的酵母Est2蛋白後來都被Tom Cech
實驗室證明是端粒酶的催化亞基：它們含有逆轉錄酶的結構域，如果對該結構域的關鍵氨基酸進行突變，
則端粒酶活性消失[19]。同年的1997年稍晚於 Tom Cech，第一個發現癌基因RAS的Robert Weinberg
也參與了這個工作，他們也報道了酵母和人的端粒酶催化亞基[20, 21]。此後，人們用體外轉錄和翻譯係統共
表達了端粒酶的催化亞基和RNA亞基，在體外重建了端粒酶活性，證明這兩個核心亞基是端粒酶活性的必需且
完備條件（sufficiency）[22]。

至此，有關染色體末端隱縮問題和保護問題的謎底終於全部揭開了。端粒與端粒酶的一係列發現完美地
解釋了這兩個問題：染色體末端的DNA由簡單重複的端粒序列構成，端粒（本文為了簡潔稱端粒DNA為端粒，
其實端粒的準確定義是端粒DNA和結合蛋白形成的複合體）保護著染色體末端，使之區別於一般的斷裂染色體末端，
而不被各種酶降解，相互之間不能融合。端粒酶負責端粒的複製，端粒酶的催化亞基利用端粒酶自己的RNA亞基
作為模板來不斷重複複製出端粒DNA，從而補償在染色體複製過程中的末端隱縮，保證染色體的完全複製。

這的確是非常完美的發現旅程。然而生物體在展示內在的簡單性的同時，還會顯示出它內在的多樣性和複雜性。
需要指出的是本文描述的隻是端粒和端粒酶領域發現的主線。實際上，細胞穿過億萬年的時光，
在漫長的進化過程中嚐試了各種可能性。端粒酶複製隻是其中一種最為普遍的解決染色體末端隱縮問題的方式。
回到最初的猜想，當時人們猜測同源重組延伸端粒的假說也並沒有錯，細胞實際上也可以通過同源重組的
方式延伸端粒[23]。裂殖酵母可以通過染色體頭尾相聯，環化的方式來避開染色體末端隱縮的問題，
在缺乏端粒的情況下生存傳代[24]。這與James Watson提出的染色體聯體的猜想頗有異曲同工之妙。
果蠅能通過轉座子的不斷複製延伸端粒[25]。而病毒更是無所不用其極，它們能夠利用蛋白[26]
或者tRNA[27]作為引物來起始基因組DNA的合成，從而使自己的染色體解決複製的隱縮問題。

不得不讚歎，進化，或者生物體，真是天才啊！

Time will tell（時間將告訴一切）-端粒和端粒酶發現曆程的啟示

從本文的描述可以看出，端粒和端粒酶最重要的發現都是在四膜蟲或者釀酒酵母這兩個低等的模式生物上獲得的。
一些低等生物，比如釀酒酵母在遺傳學操作上的相對優勢，由於技術上的發展，尤其是RNAi技術
在哺乳動物細胞上的應用，已經慢慢變小。但是這個案例仍然說明，模式生物在某種意義上沒有優劣之分，
重要的是想解決的問題是什麽，然後選擇最可能回答問題的模式生物作為材料。

隨著越來越明顯的競爭，現在中國的科學界裏充滿著浮躁的氣息。很多導師整天催逼著學生工作，
快速地發文章，申請基金，而忘了科研人員需要靜下心來閱讀文獻和縝密思考，找出問題的關鍵，
並對課題進行精心討論和設計。學生在這種環境下承擔著繁重的實驗任務，也不能充分體驗到追逐科學問題的樂趣，
逐漸散失了科研的主動性。本文提供了一個很好的科學問題推演的案例。它表明，有思想的，
原創性的成果才能真正為科學做出貢獻，並最後勝出。

不得不說，這種浮躁的氣息與科研基金的導向也密切相關。現在的項目資助都要求科研與重大疾病、
國計民生掛鉤。的確，公眾納稅人有投入就要產出的要求，而科學界的研究模式也逐漸地從
以純好奇為動力的研究演化成以社會需求為動力的研究。但是這一切都要以尊重科學自身的發展規律為前提。

科學發現的曆史一再重複著一個事實，許多偉大的發現來自於對科學基本問題的追尋，而這些重要問題的
解決必然會有在當時不能估量的應用前景。譬如端粒的發現使人工染色體得以發明，人工染色體的發明後來
又為基因組測序做出重要貢獻。其次基於已有知識的應用研究固然值得大力支持，但是首先是當前對生命基本活動
的了解還很有限，一味地往應用研究導向效果不會很明顯。中國作為一個大國，以社會需求為動力的應用研究，
和以解決在科學發展中出現的基本問題為動力的基礎研究，應該並駕齊驅，相得益彰。

最後以Liz和Carol在2004年回憶她們發現的一段話作為結尾。“Time will tell which connections 
between telomerase and health will endure... We did not set out to find a new approach to cancer therapy 
or studyspecific disease mechanisms. We were simply interested in how chromosomes are maintained...
Yet the history of medicine is filled with examples of advances from improbable places。”（時間將告訴人們
端粒酶和人類健康的何種聯係才能持久下去……我們最初並不是著手於想要找到一個新的治療癌症的方法
或者研究某個疾病的機理……但是醫學的曆史充滿了從不可能的地方獲得重大進展的例子。）[10]

附：本文提到的端粒和端粒酶發現大事記

1939年，Barbara McClintock發現玉米細胞的染色體斷裂末端容易融合
1972年，James Watson提出染色體複製的末端隱縮問題
1978年，報道四膜蟲的端粒序列
1982年，端粒的發現導致人工染色體的發明
1984年，報道酵母的端粒序列
1985年，報道四膜蟲的端粒酶活性
1989年，報道四膜蟲端粒酶的RNA亞基
1994年，報道酵母端粒酶的RNA亞基
1995年，報道酵母端粒酶活性
1996年，純化了四膜蟲端粒酶的催化亞基遺傳篩選到酵母端粒酶的催化亞基
1997年，證明了四膜蟲和酵母端粒酶的催化亞基

 參考文獻 (略)