冠狀病毒閱讀：生物學、致病性和疫苗研發

冠狀病毒閱讀：生物學、致病性和疫苗研發

by Bo

什麽是冠狀病毒？

冠狀病毒(Coronavirus)是一種有包膜（或囊膜）的正鏈線性RNA病毒，也是一種最大的RNA病毒。冠狀病毒屬於網巢病毒目。我們通常說的冠狀病毒是冠狀病毒科的兩個亞科之一。該亞科包括甲、乙、丙、丁(α，β，γ和δ )四個屬。
冠狀病毒的包膜是由雙層脂質和跨膜蛋白組成。病毒的核衣殼由正鏈RNA和一種衣殼蛋白組成，其結構為螺旋對稱結構。冠狀病毒基因組大小為26-32KB，結構高度保守，其基本構成為：5’前導序列一複製酶一S蛋白一E蛋白一M蛋白一N蛋白一3’poly(A)。3‘端有一個帽，5’端是poly(A)尾巴，長相與真核生物的mRNA相似，可以借助被感染細胞內的蛋白質合成係統合成病毒蛋白。它的基因組大約有67%用於編碼複製酶，剩下的用於編碼結構蛋白和輔助蛋白。
能感染人的冠狀病毒的有哪些？
冠狀病毒可以感染鳥類(γ和δ 屬)和哺乳動物(α和β屬)，引起呼吸道和消化道疾病。目前感染人類的冠狀病毒有七種：
1. HCoV-229E

2. HCoV-IC43

3. HCoV-NL63

4. HCoV-HKU1

5. SARS-CoV

6. MERS-CoV

7. SARS-CoV-2
HCoV-229E, HCoV-IC43,  HCoV-NL63和HCoV-HKU1可以上呼吸道感染，是輕型自限性普通感冒的病原之一，占5-35%。但在新生兒、老年人和慢性病患者身上也可以發展成肺炎。後三種是近二十年來引起多次暴發流行新型病毒，在血清學和RNA順序上和以前的病毒有較大區別。
近年來暴發流行的新型冠狀病毒疾病有哪些？
到目前為止有三種：SARS, MERS和COVID-19。
流行於2001-2003年的嚴重急性呼吸係統綜合征(SARS) 是由冠狀病毒SARS-CoV引起，造成8098人感染，774人死亡， 病死率為9%左右。
中東呼吸綜合征(MERS)流行於2012-2014年，由MERS-CoV 引起，造成855人感染，333人死亡，病死率30-40%。
冠狀病毒疾病 -19(COVID-19)是指從2019年12月從武漢開始的冠狀病毒流行。截止到2020年2月19日， 已經造成超過七萬人感染，累計死亡人數已超過兩千。COVID-19和SARS有許多相似之處，都會引起急性呼吸綜合征但也有明顯不同之處。
新型冠狀病毒從哪裏來？
一般認為，新型冠狀病毒SARS-CoV, MERS-CoV 和 SARS-CoV-2的流行是由於病毒變異導致動物病毒獲得感染人的能力，從而從動物跳越到人身上。這種跳越也發生在其它類型的病毒，如艾滋病病毒和埃博拉病毒。對病毒基因序列同源性的研究是追朔病毒進化過程的有效手段。武漢新冠病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV有很高的同源性，但它們屬於不同的進化枝，兩者分別和蝙蝠SARS樣病毒基因有更高的同源性。SARS-CoV-2 和 MERS-CoV之間的同源性約為50%，和 SARS-CoV之間的同源性79%，和蝙蝠SARS樣病毒之間的同源性88%。
冠狀病毒是怎樣感染細胞的？
冠狀病毒在其雙層脂質包膜外麵有許多球杆狀棘突，在電鏡下呈皇冠狀，並因此而得名。棘突和冠狀病毒的感染性密切相關。棘突的頂端和細胞表麵的受體結合，然後通過胞融現象將病毒的核衣殼送入細胞。棘突與細胞表麵受體結合的特異性和親和力決定了該病毒感染什動物種類和細胞類型。
冠狀病毒的宿主細胞受體是什麽？
 大量的研究表明，冠狀病毒大都利用細胞表麵的蛋白酶作為其感染細胞的受體。
組成棘突的蛋白是什麽？病毒表麵的棘突是由S膜糖蛋白以三聚體的形式組成。S蛋白有兩個區域：S1和S2。S1形成棘突的頭部；S2組成棘突的柄部。受體結合區域(Receptor Binding Domain RBD)是位於S1上麵的段較短的氨基酸序列，約從第455到第504個氨基酸。
SARS-Cov-2的受體找到了嗎？
已經證實，SARS-CoV 和SARS-CoV-2 都是利用細胞表麵的血管緊張素-I轉化酶2(ACE 2)作為它們的受體。ACE2集中分部在上呼吸道、肺II型上皮細胞以及腸道上皮細胞頂端的細胞膜上，這和冠狀病毒感染部位十分吻合。從SARS RBD-ACE2複合物的晶體結構可以看出，受體結合區RBD有多個基團和ACE2緊密結合。而且抗RBD特異性抗體可以有效地阻斷SARS病毒的感染。最近，SARS-CoV-2 S蛋白3D結構也被UT Austin 的研究者破解，從致病機理的研究和疫苗的開發都有重要意義。

 

ACE2的生理功能是什麽？
一般認為ACE2參與血壓平衡調節，其功能和ACE1的升壓功能相反。ACE2在呼吸係統的功能並不十分清楚。用內毒素誘導的小鼠實驗模型證明，緩激肽的活性降解產物DABK是ACE2的底物。抑製ACE2的活性通過產生細胞因子5(CXCL-5)導致急性炎性反應。也有研究表明，ACE2可以通過調節IL-17產生降低細菌感染引起的炎症反應。因此ACE2的一個重要功能可能就是調控肺部的炎性反應。也有一些間接的證據表明，降低ACE2活性和肺纖維化有關。這些發現可以冠狀病毒肺炎的病理機製和治療提供思路。
冠狀病毒和受體結合後是怎樣進入細胞的？
和受體結合後，S蛋白被細胞蛋白酶TMPRSSs切割去除S1區，暴露出位於S2區的融合區，從而促使病毒包膜和細胞膜係融合，使得病毒核衣殼進入細胞漿。從核苷酸順序上來看，新型冠狀病毒在S1和S2之間的蛋白酶切割位點插入了PRRA四個氨基酸，這可能使得切割更為有效。進入細胞後，病毒利用細胞本身的蛋白質合成係統合成複製酶及其他結構蛋白和輔助蛋白。
冠狀病毒是如何複製的？
病毒基因組的複製是由病毒自身編碼的複製酶來完成。冠狀病毒的複製酶是一個RNA依賴的RNA合成酶，而不是一個反轉錄酶。因此冠狀病毒的複製不需要以DNA作為中間模板。
複製酶是一個龐大的多蛋白複合物，其形成涉及到轉錄、翻譯和蛋白水平的多層麵調控和加工，是一個極其複雜的過程。這涉及到16個非結構蛋白質(non-structural proteins or naps)。這些蛋白質的功能各種各樣，其中包括阻斷被感染細胞自身的蛋白質合成，促進細胞因子的產生，病毒蛋白的加工，RNA結合與加工、RNA解旋和複製等等。
複製酶複合物的複雜性和多活性特征給抗毒藥物的設計提供了潛在的靶點，所以挑戰與機遇並存。
複製酶的一個特點是RNA鏈的切換，導致RNA重組，從而增加病毒基因組的多樣性。這是病毒進化的一個重要機製，可以導致本來不能感染人的病毒獲得感染人的能力。
冠狀病毒的結構蛋白有哪些？
冠狀病毒的結構蛋白有四種，包括棘突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N。有些β屬病毒還編碼第五種蛋白(血凝素酯酶HE)。這些蛋白都是通過內質網係統合成的。N蛋白和病毒RNA結合形成核衣殼。M蛋白是病毒的結構膜蛋白，以二聚體的形式存在，通過和核衣殼結合促進病毒粒子的組裝。E蛋白具有離子通道活性，參與病毒的組裝和釋放。E蛋白缺失可導致病毒致病性下降。
除此之外，冠狀病毒還有8種輔助蛋白。輔助蛋白在不同進化枝之間差別較大。這些蛋白的功能還有待於進一步確定。
冠狀病毒顆粒是在哪裏組裝的？
病毒顆粒的組裝和釋放是借助於細胞的高爾基複合物係統來完成的。
抗冠狀病毒的免疫機製是什麽？
和其他病毒一樣，針對冠狀病毒的免疫機製分為三大類：
1. 非特異性免疫：主要包括幹擾素係統，NK細胞和巨噬細胞。2. 特異性體液免疫：既由B細胞和漿細胞產生中和病毒的特異性抗體3. 細胞免疫：由殺傷性T細胞、調節T細胞、記憶T細胞及其產生的白介素和細胞因子組成。
這三種免疫機製相互作用，產生有效的抑製和清除病毒感染的作用，並產生免疫記憶。由於抗病毒免疫反應需要通過攻擊受感染細胞限止病毒擴散，所以也會伴隨有不同程度的組織損傷。在身體遭遇毒力高的病毒感染時，免疫係統也可能發生失控，產生過激的免疫反應，造成嚴重的組織損傷。
冠狀病毒疫苗有多重要？
疫苗是控製惡性傳染病的一個重要手段。很多傳染病如狂犬病、風疹、流行性腮腺炎、天花、麻疹、脊髓灰質炎、乙肝、流感等都可以通過疫苗接種得到有效控製。近年來，冠狀病毒通過基因變異實現了從動物到人的跳躍，多次導致爆發流行，給人民生命財產造成巨大損失。我們已經對冠狀病毒變異和致病機製研有了深刻的認識。可以預見，類似的爆發流行在未來不可避免。因此對冠狀病毒疫苗和治療藥物研發的大規模投入迫在眉睫。
自從SARS暴發流行後，冠狀病毒疫苗的研究引起了人們的高度重視。新型冠狀病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV有諸多相似之處，僻如兩者的氨基酸順序高度同源。從細胞受體、感染部位和病理機製上都有許多相同或相似之處。因此SARS 疫苗的研發經驗對新型冠狀病毒疫苗的研製有重要的指導借鑒作用。
SARS病毒疫苗的嚐試有哪些類型？效果如何？
SARS病毒疫苗的形式包括重組減毒疫苗、活病毒疫苗載體、單個病毒蛋白、合成長肽和DNA疫苗等等。其中以全長S蛋白為基礎的SARS疫苗最為注目，成功地誘導出中和病毒的抗體。基於S蛋白的DNA疫苗也在動物實驗和初步臨床經驗中表現不錯。這或許也是SARS-CoV-2疫苗研發應該采取一個重要途徑。這種基於單個S蛋白質的疫苗的優勢在於，一旦建立疫苗生產平台，就可以通過切換S蛋白的RBD區域研發未來可能出現的新的冠狀病毒疫苗。
其它的策略包括設計能夠被抗原呈遞細胞有效加工的多肽，從而有效地誘導細胞免疫。其它的思路包括使用病毒中和抗體的被動免疫，以及利用ACE2蛋白棘突結合區為中和蛋白的人造抗體設計等。
新冠病毒SARS-CoV-2疫苖研發有哪些？
網絡上流傳較多的是強生公司、Inovio生物公司、Moderna 生物公司和一個澳大利亞的University of Queensland 的研究團隊。Inovio從非盈利組織Coaltion for Epidermic Preparedness Innovations獲得了9百萬美元的資助，將釆用DNA疫苗的形式，據稱將很快進入臨床試驗。Moderna是釆用mRNA形式，也稱將很快進入一期臨床。強生已經成功研製了埃博拉和Zika疫苗，準備用同樣的平台開發新冠疫苗。
中國的多家實驗室也在同步研發新冠疫苗。如中疾控實驗室和杭州李蘭娟團隊等正在積極分離篩選毒株；香港袁國勇團隊準備研製鼻噴式疫苗；同濟大學附屬醫院和上海斯微生物公司合作研發mRNA疫苗等等。
冠狀病毒疫苗硏發有哪些問題？
評價一個病毒的致病能力，除傳染性高低、病毒的複製繁殖能力、對宿主細胞的破壞能力和體內擴散能力以外，在很大程度上也取決於機體能不能產生有效的免疫力。
冠狀病毒疫苗的研究麵臨著許多挑戰。首先，疫苗的研製到應用非常耗時。在正常情況下，疫苗的研製需要10-15年的時間。由於基因工程技術的長足發展，疫苗的設計和生產環節大大縮短。但接下來的動物實驗和三級臨床經驗則是一個非常耗時的過程。從目前網絡來源的消息來看，最快的研發計劃也需幾個月，長則需要數年。這顯然不能解燃眉之急。
其次，冠狀病毒呼吸道疾病是通過感染粘膜上皮細胞和肺泡上皮細胞所致。產生的免疫力一般不是很持久。這就需要反複多次的接種。既便如此也可能不足以完全阻止病毒感染，而隻是讓感染變輕一些，這可能會導致病毒持續地擴散到沒有接種的易感人群中給控製流行造成巨大困難。
再者，疫苗RNA和病毒RNA之間可能會通過重組產生新的病毒，人為的造成病毒進化和感染力增加。
還有，一些研究提示，抗病毒抗體可以通過Fc受體介導進入B細胞和巨噬細胞等免疫細胞，造成免疫係統的感染。所幸的是，冠狀病毒不能在B細胞和巨噬細胞中有效地複製，因此也被稱為＂頓挫感染＂。但是，這種形式的感染有可能導致細胞因子的大量產生，誘導或加劇＂炎性細胞因子風暴＂的發生。
三期臨床經驗的最佳時機應該是在病毒流行時期。在非流時段，一般隻能通檢測抗病毒抗體和細胞免疫指標來間接評估疫苗的有效性。
研發冠狀病毒疫苗的另外一個障礙是大的製藥公司不願意進行大量投入；由於疫苗研發周期長，即使研發成功，疫情也早已過去。從政府的資助情況來看，疫情發生時期都會給予大力支持，而疫情過後則停止資助，使得參與的科研人員沒有安全感。除此之外，冠狀病毒疫苗研發也存在著許多技術障礙。
顯然，有效地控製和預防新型冠狀病毒的爆發流行需要臨床醫生、醫護人員、科研人員和流行病學者以及疾病控製人員日以繼夜地艱苦卓絕的不懈努力。在此表示深深敬意。
後記：從武漢新冠暴發以來，和冠狀病毒有關的文獻可謂是鋪天蓋地，其中也包括很多高質量的未發或待發論文稿。許多付費雜誌也紛紛免費開放相關文章。其內容包括病毒學、基因組學、疫苗研發以及流行病學統計學研究和建模等等。作者帶著自己的諸多問題對相關文獻進行了極為有限的選擇性閱讀，將閱讀筆記和大家分享。如有遺漏或錯誤之處，請在留言中指正。同時，本人也深深意識到本文內容和表達方式的晦澀，再次感謝您花時間閱讀！

作者簡介： 作者畢業於華科大同濟醫學院八零級衛生係，後受教於同濟醫學院陳兆聰教授和複旦大學李育陽教授學習分子免疫和DNA重組。在美國俄亥俄州立大學獲生化博士學位，多年從事基因調控和細胞信號傳導研究。後來在天普大學、賓夕法尼亞大學和MD安德森癌症中心學習病理。現任新澤西Marlton醫院化驗室主任和Salem Medical Center病理科主任。

 

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學習了，非常感謝