在腫瘤細胞裏用CRISPR/HDR技術成功突變一個基因的兩個拷貝

（本文是寫給生物專業人員的，尤其對CRISPR技術有興趣的網友的，不合適普通讀者，

不能算科普文章。CRISPR的背景資料請參閱Feng Zhang的“Genome engineering 

using the CRISPR-Cas9 system”，Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)）

 

背景

 

我們是作一個與激素相關的腫瘤的。這個腫瘤的治療方法已經相當完善，就是讓身體裏

不能生產激素或用一個小分子化合物搶占激素受體上激素的結合部位。但多年治療後，

會有相當比例的病人產生抗藥性。這個抗藥性機理相當複雜。我們實驗室一直致力於篩

選和現有藥物不同的機理的小分子化合物，包括受體和DNA的結合或其他與受體相關的

pathway的inhibitors。前幾年成功地篩選出了幾個不同機理的化合物，個別在細胞水

平達到了nM的級別，動物測試也在10 mg/kg的水平。

 

最近在這個領域對抗藥性腫瘤的研究發現，部分病人的抗藥性是因為受體激素結合部位

發生了突變。一個或幾個氨基酸的突變就能導致腫瘤細胞的生長不能被現有藥物抑製。

所以，我們很想知道我們篩選出來的化合物對這些突變受體是不是也起作用。理論上來

說，我們的化合物不和激素競爭，突變不會影響我們化合物的效果。但隻有試驗才能讓

人信服。因為病人的抗藥性腫瘤細胞裏往往隻有受體基因的一個拷貝突變，要測試我們

的化合物，我們必需要用隻表達突變受體的細胞。用不表達受體的腫瘤細胞作為host,

表達突變受體的思維方式並不合適。在這樣的係統裏，腫瘤細胞的生長是不依賴激素的

。這就是我提出用CRISPR/HDR在表達wild type受體的腫瘤細胞裏直接突變受體基因的

原因。

 

設計的思路

 

A。為提高成功率，決定用兩個guide sequences。這有兩個好處：1。腫瘤細胞的生長

需要該受體。我們把受體中激素結合的部位刪除一段，細胞是不會生長的。這有利於含

突變受體的細胞outgrow；2。不用多花時間來測試guide sequence的效率。理論上，一

個guide就能達到我的目的。用兩個，其中一個發揮作用的可能性很大，我就沒有測這

兩個guide的效率了。

 

B。我有作knockout老鼠construct的功底，知道同源重組的模板上，兩邊的同源arm越

長，重組的概率越高，所以，我決定不用popular的合成小片斷來作模板，而是作了一

個兩邊arm各有1.2kb的模板。兩個arm中間的部分是突變區，大約60bp。 我設計了兩個

不同的酶切位點和arms連接。這樣的好處是今後我想對這60bp中間的任何氨基酸突變，

這個construct可以拿來作backbone,隻需置換一下這個60bp的區間。

 

C.引進的兩個酶位點不改變氨基酸序列，隻方便克隆和後麵的genotyping。由於我的兩

個guide的DSB位點也在這個60bp區間，我合成這個60bp的fragment時，順便也把PAM改

了（不改變氨基酸的序列）。這樣，一但出現HDR,cas9就不會再切。

 

D.我真正讓老板接受我的設計方案的原因是篩選。我仔細看了文獻，發現這些突變的受

體都能在沒有激素的情況下，讓對應的reporter基因表達，有或沒有激素的區別不大。

我就提出了一個篩選的設想：沒有激素，含這些突變子的腫瘤細胞應該會生長，而含

wild type受體的host cell沒有激素是不生長的。所以，我可以用沒有激素的培養液來

篩選。

 

E.對host cell line的選擇：一定要確定你要突變的基因隻有兩個copy。很多腫瘤細胞有

基因擴增。另外，transfection的效率越高越好。

 

試驗流程

 

模板直接克隆進pUC18。很容易，兩個PCR/酶切好的arms；中間60bp是直接合成的，

annealing一下就好了；pUC18 vector酶切純化。四個片斷一鍋“煮”，一次成功。

transfection之前linearize plasmid，純化後備用。（考慮到linearized plasmid在

細胞裏可能沒有supercoiled plasmid穩定，我後麵用了一半linearized,一半

supercoiled。似乎效率差別不大。）

 

guide sequences直接克隆進PX459。這個一定要從兩端sequencing confirm。

 

transfection用了LP2000和LP3000。都沒問題。

 

1.5M 細胞鋪到100 mm dish 》第二天transfection（10 ug HDR template，5 ug each

guide plasmid)》 第三天,remove the medium，加新的medium和puromycin 》 puro

篩選三天，每天都換medium 》 第五天換成沒有puromycin的medium,讓細胞recovery一

天 》split cells, 1：4（一個plate到四個plates)，用沒有激素的medium篩選兩個禮

拜，每三到五天換一次medium。（我的感覺是這個兩禮拜的篩選medium，最好加點

conditional medium。一般是考慮30%左右。對在數量稀少的情況下生長慢的細胞係，

conditional medium很可能是必需的。）》顯微鏡下挑克隆。

 

conditional medium的準備：細胞在flask裏長到30-50% confluence,加入新鮮medium

（注意我必需用沒有激素的medium，所以，我會在split時就直接多放點細胞，在30-50

%的水平，用不含激素的medium)。每兩天收集medium,用0.2 um filter過濾，4度放兩

三個禮拜沒有問題。

 

我第一輪用了96-well  plate來稀釋puromycin篩選好的細胞，當時每well放了三個細

胞。我puro篩選後的細胞數量大約是15，000，也就是transfection之前的1%。放了兩

塊plate。同時用了兩個100 mm dish,每個放了約1500細胞。兩個禮拜後，發現在96-

well上找克隆太費勁，就放棄了。而兩個100 mm dish裏，肉眼找到了一個長在邊沿的

克隆。這個克隆後來在genotyping時證明是兩個拷貝都突變了的。正是這個克隆，讓我

知道了一輪能拿到多少克隆。以後所有puro篩選出來的細胞全上100 mm dish。

 

共挑了70個左右的克隆。genotyping後，知道約1/2為單拷貝突變，1/4是雙拷貝突變，

另外1/4沒有突變。我的genotyping是設計了一對PCR primers,它們正好在我的HDR 

template外麵，也就是PCR產物包括wild type和mutant。這個PCR產物然後用我在

template裏引進的兩個酶切。不切的為Wild type，切開的為mutant。最後挑選了十四

個克隆，在mRNA水平上再genotyping，證實了新的酶位點，然後sequencing。

 

 

所有70克隆，隻有一個克隆出現了兩個引進的酶位點，一個切，一個不切的現象。最後

sequencing發現，一個酶位點缺失。但所有其他改變都在。也就是說我們能把

Homologous recombination的地點定位到一個很小的範圍（實際上就在那個合成的60bp

區間，不在設計的arm上）。這是唯一一個Homologous recombination的地點離

mutation地點少於50bp的情況。考慮到每個拷貝變成matant需要兩次homologous 

recombination event（mutation兩邊，一邊一次），這麽多克隆就這麽一個，我們用

比較長的arms也許是正確的選擇。毫無疑問，用合成的小template,同樣ug的數量，分

子數可是不一樣的。也許用合成的小template，因分子數量多而彌補了短小arm的不足

。這個討論被reviewer槍斃，認為reasonable但我們沒有作對照，沒有數據支持。

 

單拷貝突變的克隆，我們sequencing了7個。酶切不動的拷貝都是有Cas9引進的indels

，但沒有HDR發生。七個克隆有五種不同的indels。我們能看出兩個guide都起了作用。

有克隆就是直接少了兩個DSB中間這一段的；也有一個DSB位點有indels的另一個沒有；

還有兩個DSB同時有indels的，估計這兩個DSB不是同時發生，而是repair好了一個，另

一個再發生的。因為這七個克隆的兩個拷貝其實都有突變，我從這裏開始，用（單/雙

）replacement來區別兩組不同的克隆。

 

所有7個單replacement的克隆中，既然那個沒有replace的拷貝都有Cas9造成DSB和

indel的痕跡，因此我們認為很可能我的puromycin篩選三天可能有些過長，隻有

transfection過程中吸收了大量DNA的細胞才存活下來。我以往的經驗是，

transfection後的第二天表達量最高，第三天就下降很多，第四天第五天就差不多消失

了。這個三天篩選可能比較長了點。而從廠家的網站上的資料表明我們這個細胞的

transfection效率該有30%，我們自己的感覺也應該在5-10%左右，而實際隻有1%的細胞

存活，也說明puromycin篩選可能過頭。這個puromycin篩選是transfected的細胞，不

需要plamids整合到genome裏麵，所以，不用長時間篩選。三天是我喜歡用的時間。我

們其實也希望有幾個克隆，一個拷貝replaced,一個是wild type。這樣就和病人的抗藥

性腫瘤細胞接近。可惜沒有拿到。也許puromycin篩選兩天，我會有更好的機會。

 

我們拿到的克隆多，統計可能有一定的意義。我計算了一下，大約15，000個

transfected cell，我能拿到十個左右單/雙拷貝replaced的克隆。也就是每1000-1500

個transfected 細胞，能拿到一個。我要沒有no-hormone medium篩選的話，要拿到一

個克隆還是不容易的，意味著genotype一千個克隆才能拿到一個。我們寫文章的時候，

查了一下文獻，在細胞水平拿到雙replacement的文章我們沒有查到（這個技術日新月

異，我們search也不深入，不敢說完全沒有。動物模型裏有。），單replacement的文

章我們找到了。我們的感覺，要沒有辦法篩選，作HDR確實不是一件容易的事情。

 

謝謝這裏給我出過主意的網友。我兩年前對CRISPR也是一竅不通，來這裏問過。特別感

謝上海植物生理所的xiao Han博士。她給了我很多主意和鼓勵。她現在應該回上海交大

了，我沒有她的聯絡地址，有認識的網友，請轉達我的謝意。

 

（二0一六年十月十日）