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前文：庚毒探源 （上）
庚毒探源，順藤摸瓜 （中）
——是人還是自然打開了武漢的潘多拉盒子？
作者：Nicholas Wade（尼古拉斯·韋德）
（作者簡介：尼古拉斯·韋德是著名的英籍作家和科技新聞記者，1942年出生於英國，1964獲英國劍橋大學自然科學學士學位。他1967年到1971年間作為科學作家和編輯服務於《自然》雜誌。1970年移民美國後從1972年到1982年在《科學》雜誌工作了10年。他1982年始加入《紐約時報》，作為其下屬的《科學時報》的專職作家和編輯工作了30年，直到2012年退休，之後還作為自由作家經常為《紐約時報》撰稿。）
武漢病毒學研究所內部
Baric博士開發過一種通用工程方法來製作對其它物種具有攻擊能力的冠狀病毒，他曾將這個方法傳授給石博士。 他所使用的特異性靶標是培養基中和人源化小鼠（humanized mice）中的人類細胞。這些實驗室小鼠是人類受試者的一種符合醫學倫理的廉價替代品，它們經基因工程改造後可攜帶一種被稱為ACE2的人類蛋白，遍布於呼吸道的細胞表麵。
石博士回到武漢病毒研究所她的實驗室後，重啟了她用基因工程改造一種用以攻擊人類細胞的冠狀病毒的工作。
我們怎麽能這麽肯定？
我們之所以這麽肯定是因為，不知出於什麽奇怪的原因，她的工作是得到美國過敏和傳染病研究所（NIAID）資助的，這是美國國立衛生研究院（NIH）的一個分支機構。資金資助申請書是公開資料，上麵列明了她申請該資助的目的。
NIAID的研究經費下發給總承包商Daszak博士所屬的生態健康聯盟（EcoHealth Alliance），然後再由他們分包給石博士。下麵是2018和2019財政年度資助情況的部分摘錄，其中“CoV”代表冠狀病毒，“S蛋白”指病毒的刺突蛋白。
CoV種間傳播的測試預測。通過實驗測試宿主範圍的預測模型（即病毒爆發的可能性），包括反向遺傳學、假病毒和受體結合試驗，以及用來自不同物種和人源化小鼠的一組細胞培養基做病毒感染實驗”。
- “我們將使用刺突蛋白的序列數據、感染性克隆技術、體外和體內感染實驗以及受體結合分析來驗證用刺突蛋白序列差異百分比閾值來預測病毒外溢可能性的假說。”
用非技術語言來說，這意味著石博士的目標就是製造出一種對人類細胞具有最高感染力的新型冠狀病毒。她的計劃是要找到對人體細胞具有高低不同親和力的刺突蛋白的編碼基因。然後她再把這些刺突蛋白的基因一個接一個地插入若幹病毒基因組的骨架（即所謂“反向遺傳學”和“傳染性克隆技術”），從而製作出一組嵌合型病毒。然後她再測試這些嵌合病毒攻擊人類細胞培養基（即“體外”）和人源化小鼠（即“體內”）的能力。這些信息將有助於預測冠狀病毒從蝙蝠到人躍遷的所謂“外溢”的可能性。
就其研究方法而言，目的是要尋找能夠感染人類的冠狀病毒骨架和刺突蛋白的最佳組合。很可能該方法已經製造出了類似於SARS2的其它病毒，而且很可能找到了病毒骨架和刺突蛋白的最佳組合而製造出了SARS2本身。
尚不能確定石博士是否真的在她的實驗室中製造了SARS2，因為她的研究記錄已被封存。但似乎她確實在朝這個方向在走。羅格斯大學分子生物學家、和生物安全著名專家Richard H. Ebright說：“很明顯，武漢病毒學研究所正在係統地製作一種新型的嵌合冠狀病毒，並評估這些病毒感染人類細胞和感染能夠表達人的ACE2的小鼠的能力”。
Ebright博士還說：“同樣清楚的是，取決於分析時所選擇的常基因組背景的不同，這項工作可能產生了SARS2本身，或SARS2的某個近祖”。這裏說的 “基因組背景”指用於刺突蛋白的試驗台的某個特定的病毒骨架。
現在已經很明顯，SARS2來自武漢病毒研究所實驗室逃逸這個說法並非僅僅是個粗略的猜測，這個說法根據的是一個詳細的研發資金申請書，根據的是拿到NIAID資助的一個特定項目。
如果問即使有了上麵申請資助的工作計劃，但你如何知道該計劃確實被執行了？對此我們可以用Daszak博士自己的話來回答。Daszak博士在過去的15個月中不斷抗議說實驗室逃逸論是那些反中分子發明的一種荒謬的陰謀論。
在大流行爆發之前的2019年12月9日，Daszak在接受采訪時用各種溢美之詞介紹了武漢病毒研究所的科研人員如何重新編程刺突蛋白並製作出能夠感染人源化白鼠的嵌合型冠狀病毒。
Daszak在此采訪進行到約28分鍾時說，“經過6到7年的努力，我們現在已經發現，存在100多種與SARS相關的新型冠狀病毒，它們和SARS極為相近” 。 “其中一些在實驗室中能夠進入人體細胞，另外一些會在人源化的小鼠模型中引起SARS疾病，而且該疾病無法通過單克隆抗體治愈，所以也無法通過疫苗來預防。因此，這是個明確並現實的危險...”
“采訪人：您說的這些不同的冠狀病毒，既不能針對它們進行疫苗接種，也無法抗病毒，那麽我們該怎麽辦呢？”
“Daszak博士：嗯，我想是這樣，冠狀病毒嘛，你可以在實驗室中很容易地操控它們。刺突蛋白會導致很多冠狀病毒引發的畜傳人風險。您可以獲得基因序列，也可以構建蛋白，我們與北卡大學（UNC）的Ralph Baric有很多合作。我們可以在主鏈中插入另一種病毒並做些實驗室操作。因此，當您發現一個序列時，您將有更大的預測能力。您擁有這種多樣性。現在，研發疫苗的合理做法是，當你開發一款SARS疫苗時，會用流行性的SARS（Pandemic SARS）來做，不過，讓我們插入其他一些東西，這樣就可以獲得更好的疫苗。” 這裏所謂插入的東西，可能含有一個被稱為弗林蛋白酶切割位點的元素。下麵我會談到，該元素會大大增加病毒對人類細胞的感染性。
Daszak博士斷斷續續說出了這樣一個事實，即一旦產生了某種可以攻擊人類細胞的新型冠狀病毒，您就可以獲取該病毒的刺突蛋白並將其作為研發疫苗的基礎。
我們可以想象一下幾天後Daszak博士聽到武漢爆發疫情時的反應。他比任何人都清楚武漢研究所的目標就是如何讓蝙蝠冠狀病毒對人產生傳染性，也清楚該所在保護本所研發人員免遭病毒感染方麵的缺陷所在。
但是，他非但沒有向政府衛生當局提供自己所掌握的大量病毒研發信息，而是立即發起了一場公關運動，以圖讓全世界相信疫情的爆發並非來自他所研製的某個病毒。他在2020年4月的一次采訪中宣稱， “新冠病毒從實驗室逃逸的說法純屬瞎說，這根本不是真的”。
武漢病毒學研究所的安全措施
Daszak博士也許沒有意識到，抑或他太過了解，長期以來，即使是管理最好的實驗室也很難避免病毒的逃逸。天花病毒在1960年代和1970年代在英國從實驗室中逃逸過3次，造成80例感染和3例死亡。自那時起，幾乎每年都有危險病毒從實驗室泄漏的情況。近些年來，SARS1病毒成了逃逸大師，分別從新加坡和台灣的實驗室中泄漏，並從位於北京的中國國家病毒學研究所泄漏了至少四次。
SARS1難以對付的原因之一是沒有可用的疫苗來保護實驗室的工作人員。Daszak博士在上麵12月19日的采訪中說，武漢病毒研究所也未能開發出疫苗來對付他們自己製造的用來感染人類細胞的冠狀病毒。如果SARS2病毒是在武漢實驗室中製作的，那麽武漢的工作人員對該病毒是完全無法防護的，正如他們在北京的同事們對SARS1完全無法防護一樣。
新型冠狀病毒高危的第二個因素與實驗室所需的安全等級有關。實驗室的安全等級分為從BSL1到BSL4的四個等級，其中BSL4的防護最為嚴格，它是專為致命性病原體（例如埃博拉病毒）而設計的。
武漢病毒研究所擁有一個新的BSL4實驗室，但其管理鬆弛狀態令美國駐北京使館去該所檢查工作的國務院檢查官大為震驚。“新實驗室嚴重缺乏安全操作所需的經過適當培訓的技術人員和調查人員“，該檢查員在2018年1月19日的電報中如此寫道。
但是，真正的問題並不是武漢BSL4實驗室是否安全，而是全世界的病毒學家都不喜歡在BSL4所要求的條件下工作。您必須穿著宇航服，在密閉的櫥窗中進行操作，並忍受做什麽都得多花一倍時間。因此，每種病毒真正對應的安全級別總是比安全設計的標準低。
在2020年之前，包括中國在內的各國的病毒學家所遵循的規則要求在BSL3實驗室條件下對SARS1和MERS病毒進行操作，但其它蝙蝠冠狀病毒均可以在低一級的BSL2實驗室中操作。BSL2實驗室隻有最起碼的安全預防措施，例如戴手套、穿實驗服、不在移液器中吸入液體並張貼生物危害警告標誌。然而，在BSL2中做功能增強實驗（GOF）所產生的某種媒介可能比SARS1或MERS的傳染性還要強。如果出現這種情形，那麽實驗室工作人員將極有可能被感染，特別是如果沒有接種疫苗。
如石博士在其出版物和其他文件中所描述的那樣，她的功能獲得性（GOF）冠狀病毒研究工作很多是在BSL2實驗室進行的。她在接受《科學》雜誌采訪時說：“我們對冠狀病毒的研究工作是在BSL2或BSL3實驗室中進行的。”
Ebright博士說，“顯然，該工作的部分或全部工作是在生物安全等級2下操作的，這個標準相當於美國標準牙醫診所的生物安全等級，會對實驗室工作人員在接觸具有SARS2傳染特性的病毒時造成不可接受的風險。
他補充說：“很顯然，這項工作不應該得到資助，也不應該被執行。”
這就是他的觀點，無論SARS2病毒是否真的是在該實驗室中產生的。
對武漢實驗室安全條件的擔憂似乎並不多餘。根據美國國務院於2021年4月21日的情況通報，“美國政府有理由相信，在發現首例COVID-19病例之前的2019年秋季，武漢病毒研究所的幾名科研人員就已被感染，其症狀與COVID-19和常見的季節性疾病一致。”
哈德森研究所（Hudson Institute）研究員、國務院前顧問David Asher在一次研討會上提供了有關該事件的更多詳細信息。他說，我們對該事件的了解一部分來自公共信息，另一部分來自情報人員收集的一些高端信息。在該研究所的BSL3實驗室工作的三個人在一周之內都病倒了，均出現嚴重症狀並需接受住院治療。這是“我們所了解到的COVID-19的第一批已知受害者。”他說，不能完全排除流感的可能，但在當時情況下似乎不太可能。
比較SARS2起源的兩個對立說法
上麵提到的證據讓我們更加相信SARS2病毒是在實驗室中製作的並逃逸了。這說法很嚴重，但無論多麽嚴重，都缺乏實錘證據。實錘證據是，SARS2或其前體的確是在武漢病毒研究所或其相關實驗室開發的。由於無法獲取此類記錄，另一個替代方法是列出有關SARS2病毒若幹重要事實，然後看兩個對立起源解釋（自然發生論和實驗室逃逸論）哪個能做出更好的解釋。下麵是對兩種假說的四個檢驗，其中的兩個涉及技術細節，對那些願意深究的人來說，這些技術細節可能最具說服力。
1）起源地
讓我們從地理位置開始。SARS病毒的兩個已知近屬是從中國南部省份雲南山洞中的蝙蝠身上收集的。如果SARS2病毒先感染了雲南這些山洞附近地區的居民，那將強烈支持該病毒是自然傳播給人類的說法。但實際情形不是這樣，疫情首先在遠離山洞1500公裏外的武漢市爆發。
SARS2所屬的蝙蝠病毒家族叫β-冠狀病毒，它會感染遍布中國南部中菊頭蝠（Rhinolophus affinis）。蝙蝠的活動範圍大約是50公裏，所以不可能到達武漢。無論如何，第一波Covid-19爆發的時間是2019年9月，當時湖北省的氣溫已經很低，足以使蝙蝠進入冬眠狀態。
會不會蝙蝠病毒先感染了一些中間宿主？如果如此，需要蝙蝠種群長期與中間宿主頻繁接觸，而此中間宿主還須經常與人接觸。假設真有此病毒交換，該交換一定是在武漢這個繁華的都市之外進行的，因為我們知道武漢市並不是菊頭蝠群的自然棲息地。邏輯上說，攜帶這種高傳染性病毒的被感染者（人或動物）一定在去武漢的途中沒有傳染過任何其他人，而且他或她的家人中沒有人發病，如果該人是乘坐火車去的武漢，也沒有其他乘客被傳染。
換言之，如果該病毒是在武漢以外的地方產生的話，那麽該病毒必須一路不留任何痕跡，直接在武漢爆發。
用實驗室逃逸說來解釋的話，武漢起源說就很好理解。武漢是中國冠狀病毒研究的領先研究中心，如上所述，那裏的研究人員一直試圖通過基因工程將蝙蝠冠狀病毒改造的能夠攻擊人類細胞。而且他們是在安全性最低的BSL2實驗室中做的這項工作。如果在那裏做出了不曾預料的高傳染性的SARS2的病毒，則其逃逸就不足為奇了。
2）病毒自然史與進化
瘟疫爆發的最初地點隻是病毒自然史這個大問題的一小部分。病毒並不會一次接觸就從一種物種跳到另一種物種。那些適變成能夠攻擊蝙蝠細胞的冠狀病毒刺突蛋白需要反複多次跳到另一個物種（其中大多數會失敗），才能獲得幸運的突變。這個突變使得RNA單元發生了某種變化，導致某個異樣的氨基酸被結合進刺突蛋白中，使其具有攻擊其它物種細胞的能力。
通過多次這樣的變異調整後，該病毒逐漸適應了它的新宿主，例如一些蝙蝠經常接觸的動物。之後，當病毒從中間宿主向人傳播時，以上過程再次被重複。
對於SARS1，研究人員記錄了其刺突蛋白的連續變化，即該病毒是如何逐步演變成危險的病原體的。SARS1病毒從蝙蝠傳給靈貓後，其刺突蛋白經6次突變成為一種溫和的病原體後才傳給人類。之後又經14次突變後變的更加適應人體，再經過4次突變後開始爆發疫情。
可是當你在SARS2病毒中企圖尋找類似的突變路徑時，會感到出奇的詫異。至少到近期，該病毒幾乎沒有任何變異。該病毒從出現之始就很好地適應了人類細胞。布羅德研究所（Broad Institute）Alina Chan所領導的研究人員將SARS2與後期已經適應了人體的SARS1進行了比較，發現這兩種病毒均具有類似的人體適應性。他們寫道：“當2019年末首次檢測到SARS2時，它已經預先適應了人類傳播，其適應程度與病毒在疫情後期的人體適應性相似。”
即使是那些反對實驗室起源說的人也認為SARS2基因組具有不同尋常的一致性。Baric博士寫道：“在中國武漢發現的早期菌株的遺傳多樣性十分有限，這表明該病毒可能出自某個單一來源。”
顯然，單一來源與實驗室逃逸說相吻合，而與自然發生論相矛盾，因為自然演化的基本特征就是存在大量的變異和選擇。
SARS2基因組結構的高度一致性說明不存在什麽中間宿主，而且在自然中的確也沒有發現有這種宿主。
自然發生論的支持者（嘲諷地）說，SARS2在獲得其傳染特性前可能是在某個人群中經曆過孵化，不過這個人群還不知道在哪裏。或者說該病毒直接跳到了中國之外的某個中間宿主身上。
以上這些猜想都是可能的，但是很牽強。實驗室泄漏說的支持者有一個簡單的解釋。 之所以SARS2從一開始就適應了人類細胞，是因為該病毒就是在實驗室中用人源化小鼠中或在人類細胞培養而成的，正如Daszak在資助申請書中描述的那樣。它的基因序列幾乎沒有任何多樣性，因為實驗室培養物的標誌就是基因序列具有高度一致性。
實驗室發生說的支持者如此戲說：SARS2病毒當然在傳播給人類前先感染了某個中間宿主。我們已經找到了這個中間宿主，它就是武漢病毒學研究所使用的人源化小白鼠。
3）弗林蛋白酶切割位點（Furin Cleavage Site）
那麽，SARS2是如何獲得其弗林蛋白酶切割位點的呢？它既可以自然地獲得，也可以在功能獲得實驗（GOF）中將其插入S1/S2的交界處而獲得。
先來考慮自然起源論。病毒演化靠兩種方式，一是突變，二是重組。突變是個DNA（或冠狀病毒的RNA）隨機變化的過程，其結果通常是蛋白鏈中的某個氨基酸被另一個所置換。這些突變大多數對病毒演化是有害的，但自然選擇總會保留下若幹有用的突變。SARS1刺突蛋白的靶向偏好逐漸從蝙蝠細胞轉換為靈貓細胞，然後再轉到人類細胞，靠的就是這種突變。
突變似乎不太可能產生SARS2的弗林蛋白酶切割位點，盡管不能完全排除這個可能。該位點的四個氨基酸單元聚在一起，並且都位於S1 / S2連接處的正確位置。突變是由複製錯誤（當產生成新的病毒基因組時）或部分基因組發生化學變性時隨機產生的。因此，它通常會影響蛋白鏈上不同位置上的單個氨基酸。像弗林蛋白酶切割位點那樣的一串氨基酸更有可能通過另一種流程，即所謂重組（recombination），而被整體獲得。
重組是當兩種病毒侵入同一細胞時，兩種病毒的基因組材料發生偶然的交換時發生的，其後代是用另一個病毒的RNA的基因碎片組裝而成的。β-冠狀病毒隻會與其他β-冠狀病毒結合，但可以通過重組獲得共同基因池中的任何遺傳要素。他們唯一無法獲得的是基因池中所不存在的要素。我們知道，沒有任何與SARS相關的β-冠狀病毒（SARS2所屬的類）具有弗林蛋白酶切割位點。
自然發生說的支持者說，SARS2的弗林蛋白酶切割位點可能是從一些未知β-冠狀病毒中獲得的。不過與蝙蝠SARS相關的β-冠狀病毒顯然不需要弗林蛋白酶切割位點來感染蝙蝠細胞，因此SARS2不大可能真正含有這樣一個位點，而且事實上目前還沒有發現此位點。
自然發生說的支持者的下一個論點是，SARS2是從人體中獲得的弗林蛋白酶切割位點的。他們說SARS2的前體可能已經在人群中傳播了數月或數年，在此過程中SARS2從人類細胞中獲得了弗林蛋白酶切割位點，這時就該爆發疫情了。
果真如此的話，醫院的監控係統中應有被緩慢演化的SARS病毒所感染的病人的記錄。但是到目前為止，還沒有發現任何記錄。根據世界衛生組織關於該病毒起源的報告，湖北省（武漢市所在的省）的監控醫院定期監測流感樣疾病，但“並無任何證據表明在2019年12月爆發新冠之前的幾個月中有大量SARS-2傳播。”
因此，很難解釋SARS2病毒是如何自然地通過突變或重組獲得弗林蛋白酶切割位點的。
剩下隻有功能獲得實驗（GOF）還沒有討論了。對於那些認為SARS2來自實驗室逃逸的支持者而言，解釋弗林蛋白酶的切割位點不是個問題。Steven Quay博士是位對SARS2起源感興趣的生物技術創業者，他寫道： “自1992年以來病毒學界就知道，製造致命病毒的一種可靠方法就是在實驗室中在S1/S2交界處加入弗林蛋白酶切割位點” 。他還說， “在公開發表的文獻中，包括武漢冠狀病毒研究病毒所所長石正立在內，至少涉及11個功能獲得實驗，都是在SARS病毒中加入弗林蛋白切割位點使其具有更強的感染性。”
4）密碼子問題
眾所周知（或至少可以回想一下高中課本），遺傳密碼使用三個DNA單位（堿基）來表示蛋白鏈上的每個氨基酸單位。當以3個為一組進行讀取時，這4個不同的DNA單位可以產生4 x 4 x 4或64種不同的三聯體，或稱“密碼子” （codons）。由於隻有20種氨基酸，因此密碼子的數量遠遠多餘氨基酸的數量，所以相同的氨基酸可能以多個密碼子來表示。例如，氨基酸中的精氨酸（arginine）可以用六個不同的密碼子（CGU，CGC，CGA，CGG，AGA或AGG）來表示，其中的A、U、G和C代表RNA中的四種不同單元。
這就是有趣之處。不同的生物體具有不同的密碼子偏好。人體細胞喜歡用CGT、CGC或CGG來表示精氨酸，但其中的CGG則是冠狀病毒最不喜歡的精氨酸表示方法。在研究SARS2基因組中的氨基酸在弗林蛋白切割位點如何被編碼時，請記住這一點。
現在從功能的角度來談談為什麽SARS2帶有弗林蛋白酶切割位點而其表親病毒則無此位點。通過計算機可將SARTS2和其近親冠狀病毒（最接近的是RaTG13）基因組的近30,000個核苷酸的序列串進行排列和比較。可見，與RaTG13相比，SARS2在S1/S2連接處插入了12個核苷酸。插入物的序列是T-CCI-CGG-CGG-GC。CCT用以編碼脯氨酸（proline），兩個CGG用以編碼兩個精氨酸（arginines），而GC則是用來編碼丙氨酸（alanine）的GCA的起始密碼子。
這個插入物有許多奇怪的特性，但最奇怪的是兩個並排的CGG密碼子。SARS2的精氨酸密碼子中隻有5％是CGG，而任何β-冠狀病毒中都沒有發現過雙CGG CGG密碼子排列。那麽SARS2是如何獲得這5%的CGG的呢？要知道，CGG被人類細胞所偏愛，但並不為冠狀病毒所偏愛。
自然發生論的支持者要解釋SARS2的弗林蛋白酶切割位點各種特征可不容易。他們必須假設在病毒基因組上極少發生重組的位點上的確發生了重組事件，還要解釋為什麽會在SARS2在S1/S2點位（這可是冠狀病毒基因組中唯一能夠大大加強病毒傳染性的重組點位）插入12個核苷酸序列，其中還含有β-冠狀病毒庫根本沒有的一對精氨酸CGG密碼子。
進化總是會產生小概率事件，Robertson博士這句話看似正確但其實不然。病毒可以產生無數變體，但我們能看的，隻是自然選擇後活下來的十億分之一。Robertson博士的觀點過於誇大了自然產生小概率事件的能力。例如，功能獲得實驗（GOF）的任何結果都可以解釋為進化可以在時間中實現的事情。數字遊戲也可以用另一種方式玩。為了讓弗林蛋白酶切割位點在SARS2中自然發生，必須發生連續發生一係列事件。我們上麵說過，這個事件鏈中的每一個都是小概率事件。一條帶有若幹小概率事件的長鏈是不可能完成的。
按照實驗室逃逸論，SARS2中含有一對CGG密碼子就不奇怪了。這個人類偏愛的密碼子在實驗室中經常使用。因此，凡試圖在病毒基因組中插入弗林蛋白酶切割位點者，就會在實驗室中合成能製備PRRA的序列，並且很可能會使用CGG來實現。
（待續）
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