關於提高新型冠狀病毒核酸陽性檢出率以及速度的對策(草稿)
作者：柳涯客
目前，新型冠狀病毒的疫情仍然十分嚴重，截至3月9日，中國確診病例37288，疑似病例28988，死亡813例。湖北省委書記蔣超良2月8日要求：“兩天內檢測完武漢所有疑似患者”。而工程院的副院長、中國醫學科學院院長王辰院士接受央視《新聞1+1》采訪披露：“目前核酸檢測的陽性率隻有30-50%”。也就是說，同一個臨床疑似肺炎病人，檢測2-3次才有一次陽性結果。
據我的了解，現時武漢的日均核酸檢測能力隻有6000/天。從疫情公布以來，疑似病例數和確診病例每日攀升，要完成湖北省委書記蔣超良2月8日要求隻有靠CT檢查。那麽，有沒有可能兩天內檢測完武漢所有疑似患者？完全可能，但我們需要改進核酸檢測的技術和方法。
核酸檢測的主要問題是陽性率低和檢測速度跟不上。最敏感的核酸檢測實時RT-PCR方法大概隻能檢出5個病毒以上的感染。病毒感染在下呼吸道（包括肺），現在取樣主要是咽拭子，少部分病人的痰和肺泡灌洗液。肺泡灌洗液的陽性率最高，但時間長，技術要求高，無法推廣。新型冠狀病毒感染者以幹咳為主，痰少取不到樣。
我們需要成立科技攻關小組，做多方麵的嚐試，攻克核酸檢測的技術和方法的限製，在近期集中解決幾個重要的問題, 我的分析和對策是：
1. 為了提高陽性檢出率，改進取樣
1）改進取樣方法，采用標準和多個拭子取樣點
取樣病毒量少是核酸檢測陽性率低的關鍵原因。鼻拭子和咽拭子說白了就是護士拿棉簽刮一下鼻和咽送檢。另外病程的時間段（早期，中期和危重期), 刮的位置和手法個人不同也是導致30-50%陽性率的原因。提高檢出率的核心在於提高病毒取樣量。
如果采用標準取樣點，固定取樣的位置，如口腔9點，12點位等，可以避免護士刮的位置和手法不同所造成的采樣差異。另外建議多個拭子取樣（2-5個）可以增加病毒數量2-5倍，提高陽性率。
由於鼻腔更接近下呼吸道，因而鼻拭子的陽性率可能好於咽拭子，所以建議改為鼻拭子，可以與咽拭子做比較。
2）改進拭子材料
棉簽雖然方便，但取樣後不易洗脫病毒，效率受到影響，將來爭取用易裂解的材料作拭子, 不洗脫，可以提高病毒的數量。
3）改進取樣途徑
輕症病人增設洗鼻液，漱口液; 肺炎病人增設血液。顯然，肺泡灌洗液不適合輕症病人，那麽，洗鼻液和漱口液就值得嚐試了。洗鼻的方法如同過敏性鼻炎的洗鼻。洗鼻液和漱口液離心2分鍾 (10000RCF) 收集細胞。我覺得洗鼻液的陽性率可能會比鼻拭子高。將來開發病毒吸附劑可能改善富集方法，增加病毒數量。
雖然血液細胞不是病毒最易感的細胞（肺泡細胞是），但肺的血液供應非常豐富。人體器官中心髒、胰髒、腎髒、胃髒、脾髒、肺部、腸道、膀胱在生命活動過程中都會耗氧，心髒不是全身耗氧量最高的器官，肺部器官耗氧最多。因此，如果新型冠狀病毒感染到肺，收集肺炎病人的血做核酸檢測就十分合理。但是，2020年1月24日發表在Lancet的文章中用了住院肺炎病人的血做核酸檢測，陽性率為15%。是不是不值得提倡？在我看來，他們的方法不是最好，可以改進，例如加大血的用量（從80微升加大為240微升），最後洗脫溶液減少（50微升變為10微升），這樣的改進可以提高病毒數量15倍。即使是15%陽性率，依然可以作為補充。
4）避免運輸和待檢過程降解
運輸和待檢過程長達數小時至2天，期間的病毒RNA降解也是需要考慮的因素，我的對策是：提取RNA 之前采樣和病毒滅活由護士進行，然後密封常溫運輸至檢測室，加病毒滅活溶液後能防止病毒RNA降解。
2. 提高新型冠狀病毒核酸檢測速度
為什麽武漢的日均核酸檢測能力隻有6000/天？限速環節主要在於操作安全等級和核酸提取。我的改進對策有這幾個方麵：
1）擴大符合要求的生物檢測室
新型冠狀病毒在中國定為乙類甲管，即國家衛健委應急辦主任許樹強介紹的“國務院已經將新型冠狀病毒感染的肺炎納入法定的傳染病，定為乙類甲管，即乙類傳染病按照甲類傳染病的預防控製措施進行管理”。但是預防控製可以，核酸檢測就不必參照甲類。
2020年1月16日前，即使1月7日新型冠狀病毒的基因序列公布後，數家公司在幾天內推出檢測試劑盒（最快的24小時後出產品）獲得快速批準，但中國所有的新型冠狀病毒核酸檢測都要求送到北京疾控中心（中國CDC）檢測，此後雖然下放了權限，但符合P3安全等級的生物實驗室數目有限。樣品低溫運輸也很不方便。
美國FDA2月4日前，所有的新型冠狀病毒核酸檢測都要求送到美國疾控中心（CDC）檢測，等待時間為2-5天。FDA2月4日緊急下放檢新型冠狀病毒測權限到各地區CDC核準授權實驗室，加快了檢測進程(附1, 2)。但是美國隻有12例感染者，沒有太大的檢測需求。
我的建議：病毒滅活由護士病人采樣後迅速進行，然後密封常溫運輸至“雲神山檢測室”進行核酸提取。也可以考慮此後逐次降低安全等級，後麵的在安全等級稍低的生物試驗室進行檢測。雲神山檢測室是我起的名字，大概可以容納100個檢驗員，每個人8小時可以提取200個樣品的核酸。
2）檢驗員人數
找不到足夠檢驗員怎麽辦，武漢有60多家醫院，每個醫院抽3個人不難。全國已支援萬多醫務人員，增加支援200個檢驗員應該可行, 這樣就是200人。另一個選擇則是招募200個生物研究生或醫學本科生（上過生物實驗科），培訓半天就可以勝任。
3）檢測機器數量
一個人和一台機器實時PCR儀8小時大概能人工檢測650-1000個樣品，樣品檢測後消毒就行。小型機器人就更快了，每台儀器可做10000個樣品/天。
4) 病毒滅活劑 (TRIZOL)
病毒滅活劑 (TRIZOL)的主要成分是苯酚。苯酚的作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白變性，釋放核酸物質 (RNA)。由於苯酚不能完全抑製RNA酶活性，TRIzol中還加了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、貝塔巰基乙醇等來抑製內源和外源RNA酶。參見附3, 微量總 RNA 提取試劑盒及方法。
總之，100個檢驗員15台機器一天就可以人工檢測2萬個樣品, 我覺得200人30台機器一天檢測4萬樣品應該能夠實現。
以上是我的關於提高新型冠狀病毒核酸陽性檢出率和速度的對策，希望轉貼或轉告。隻要有關國家或武漢市領導能夠看到並考慮提高新型冠狀病毒核酸陽性檢出率和速度, 也是我們大洋彼岸華人科學家為戰勝新型冠狀病毒疫情出的一分力。
2-9-2020
附1：CDC-2019-nCoV-Authorization
附2: 美國FDA緊急授權通知(機器翻譯版)
附3: 微量總 RNA 提取試劑盒及方法, 根據Huang C 等(Lancet. 2020 Jan 24) 方法改編
如沒有特別興趣以下附件可以略過
附1. CDC-2019-nCoV-Authorization
Robert R. Redfield, MD
Director
Centers for Disease Control and Prevention 1600 Clifton Rd., MS D-14
Atlanta, GA 30333
Dear Dr. Redfield:
This letter is in response to your request that the Food and Drug Administration (FDA) issue an
Emergency Use Authorization (EUA) for emergency use of the Centers for Disease Control and
Prevention (CDC) 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time Reverse Transcriptase
(RT)-PCR Diagnostic Panel for the presumptive qualitative detection of nucleic acid from the
2019-nCoV in upper and lower respiratory specimens (such as nasopharyngeal or
oropharyngeal swabs, sputum, lower respiratory tract aspirates, bronchoalveolar lavage, and
nasopharyngeal wash/aspirate or nasal aspirate) collected from individuals who meet CDC
criteria for 2019-nCoV testing, pursuant to Section 564 of the Federal Food, Drug, and
Cosmetic Act (the Act) (21 U.S.C. §360bbb-3). Testing is limited to qualified laboratories
designated by CDC and, in the United States, certified under the Clinical Laboratory
Improvement Amendments of 1988 (CLIA), 42 U.S.C. § 263a, to perform high complexity
tests.1
On Feburary 4, 2020, pursuant to Section 564(b)(1)(C) of the Act, the Secretary of the
Department of Health and Human Services (HHS) determined that there is a public health
emergency that has a significant potential to affect national security or the health and security of United States citizens living abroad, and that involves the 2019-nCoV. Pursuant to Section 564 of the Act, and on the basis of such determination, the Secretary of HHS then declared that
circumstances exist justifying the authorization of emergency use of in vitro diagnostics for detection and/or diagnosis of the novel coronavirus (2019-nCoV) subject to the terms of any authorization issued under Section 564(a) of the Act.2
Having concluded that the criteria for issuance of this authorization under Section 564(c) of the
Act are met, I am authorizing the emergency use of the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR
Diagnostic Panel (as described in the scope Section of this letter (Section II)) in individuals who
1 For ease of reference, this letter will refer to “qualified laboratories designated by CDC and, in the United States, certified under the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (CLIA), 42 U.S.C. § 263a, to perform high complexity tests” as “authorized laboratories.”
2 U.S. Department of Health and Human Services, Determination of a Public Health Emergency and Declaration that Circumstances Exist Justifying Authorizations Pursuant to Section 564(b) of the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act, 21 U.S.C. § 360bbb-3. Feburary 4, 2020
Page 2 - Dr. Redfield, Centers for Disease Control and Prevention
meet CDC criteria for 2019-nCoV testing for the presumptive detection of 2019-nCoV by authorized laboratories, subject to the terms of this authorization.
I. Criteria for Issuance of Authorization
I have concluded that the emergency use of the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR
Diagnostic Panel in individuals who meet CDC criteria for 2019-nCoV testing meets the
criteria for issuance of an authorization under Section 564(c) of the Act, because I have
concluded that:
1. The 2019-nCoV can cause a serious or life-threatening disease or condition, including
severe respiratory illness, to humans infected by this virus;
2. Based on the totality of scientific evidence available to FDA, it is reasonable to believe
that the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel may be effective in
diagnosing 2019-nCoV infection, and that the known and potential benefits of the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel, when used for diagnosing 2019-nCoV infection, outweigh the known and potential risks of such product; and
3. There is no adequate, approved, and available alternative to the emergency use of the
CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel for diagnosing 2019-nCoV
infection.3
II. Scope of Authorization
I have concluded, pursuant to Section 564(d)(1) of the Act, that the scope of this authorization is limited to the use of the authorized CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel by authorized laboratories for the presumptive detection of 2019-nCoV in individuals who meet CDC criteria for 2019-nCoV testing.
The Authorized CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel
The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel is for the presumptive detection of
2019-nCoV RNA in upper and lower respiratory specimens (such as nasopharyngeal or
oropharyngeal swabs, sputum, lower respiratory tract aspirates, bronchoalveolar lavage, and
nasopharyngeal wash/aspirate or nasal aspirate), and other authorized specimens collected from
individuals who meet CDC criteria for 2019-nCoV testing. The testing procedure consists of
nucleic acid extraction and purification from the human specimen using authorized extraction
methods/instruments followed by real time RT-PCR, where the RNA is reverse transcribed into
cDNA and then amplified using the primer sets and detected using specific probes. The real time
reverse transcriptase (RT)-PCR is performed on the FDA cleared Applied Biosystems 7500 Fast
Dx Real-Time PCR Instrument with SDS 1.4 software, or other authorized instruments or
software.
The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel includes the following materials or other authorized materials:
3 No other criteria of issuance have been prescribed by regulation under Section 564(c)(4) of the Act. 
Page 3 - Dr. Redfield, Centers for Disease Control and Prevention
· 2019-nCoV_N1, 2019-nCoV_N2 and 2019-nCoV_N3 vials containing primers and
probes that target the nucleocapsid (N) gene and are designed for both universal
detection of SARS-like coronavirus as well as specific detection of the 2019-nCoV
· RP vial containing the internal control primers and probes that target the Human
RNase P gene
· nCoVPC vial containing the 2019-nCoV positive control used in the assay
The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel also requires the use of additional authorized materials and authorized ancillary reagents that are not included with the test but are commonly used in clinical laboratories and are described in the authorized CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use.
The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel requires the following control
materials, or other authorized control materials; all controls listed below must generate expected results in order for a test to be considered valid, as outlined in the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use:
· Human Specimen Control (HSC): A human cell culture preparation used as an
extraction control and positive control for the RNase P primer and probe set that is
extracted and tested concurrently with each specimen extraction run.
· Positive Control for 2019-nCoV (nCoVPC): Run with each batch of specimens.
Monitors for failures of rRT-PCR reagents and reaction conditions.
· No Template Control (NTC): Nuclease-free water included in each run. Monitors for
reagent and system contamination.
· RNase P (RP) control in clinical samples: The RP primer and probe set is included in
each run to test for human RNase P, which controls for specimen quality and
demonstrates that nucleic acid was generated by the extraction process.
The above described CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel, when labeled
consistently with the labeling authorized by FDA, entitled “CDC 2019-Novel Coronavirus
(2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use” (available at
https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-
authorizations), which may be revised by CDC in consultation with, and with concurrence of, the
Division of Microbiology Devices (DMD)/Office of Health Technology 7 Office of In Vitro Diagnostics and Radiological Health (OHT7-OIR)/Office of Product Evaluation and Quality (OPEQ)/Center for Devices and Radiological Health (CDRH), is authorized to be distributed to and used by authorized laboratories under this EUA, despite the fact that it does not meet certain requirements otherwise required by applicable federal law.
The above-described CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel is authorized to be accompanied by the following information pertaining to the emergency use, which is required to be made available to healthcare providers and patients:
· Fact Sheet for Healthcare Providers: CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR
Diagnostic Panel
附2:美國FDA緊急授權通知(機器翻譯版)
2020年2月4日
羅伯特·雷德菲爾德，醫學博士疾病控製和預防中心主任，
克利夫頓路1600號，MS D-14亞特蘭大，喬治亞州30333
尊敬的博士：雷德菲爾德（Redfield）：這封信是應您的要求而答複的，美國食品藥品管理局（FDA）為疾病控製與預防中心（CDC）頒發了緊急使用授權（EUA）2019-新型冠狀病毒（2019-nCoV） -TimeReverse Transcriptase（RT）-PCR診斷小組，用於對上呼吸道和下呼吸道標本（例如鼻咽或口咽拭子，痰，下呼吸道吸出物，支氣管肺泡灌洗液和鼻咽洗液/根據聯邦食品，藥品和化妝品法（該法）第564條（21 USC§360bbb-3），從符合CDC標準以進行2019-nCoV檢測的個體中收集的吸出物或鼻吸出物）。測試僅限於CDC指定的合格實驗室，並在美國根據美國1988年美國臨床實驗室改進修正案（CLIA）1988年認證。 §263a，以執行高複雜度測試。12020年2月4日，根據該法案第564（b）（1）（C）條，衛生與公共服務部（HHS）部長確定存在公共衛生根據該法令第564節的規定，HHS秘書隨後宣布存在這種情況，這種緊急情況可能會影響國家安全或居住在國外的美國公民的健康和安全，並涉及2019-nCoV。證明可以緊急使用體外診斷法檢測和/或診斷新型冠狀病毒（2019-nCoV）的行為要符合該法令第564（a）條頒發的任何授權條款。2得出的結論是，根據第564條第（A）款頒發該授權的標準c）符合《法案》，我授權個人緊急使用CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷麵板（如本函件第二節所述） 1為便於參考，此信將提及“美國疾病預防控製中心指定的合格實驗室，並在美國經1988年美國臨床實驗室改進修正案（CLIA）認證，美國42 §263a，作為“授權實驗室”執行高複雜度測試”。2U.S。衛生與公共服務部，《公共衛生突發事件的確定》和``存在可以證明正當授權的情況的聲明''，依據《美國聯邦食品，藥品和化妝品法》（美國聯邦法典）第21條第564（b）節。 §360bbb-3。 2020年2月4日。
-疾病控製與預防中心的Redfield博士符合CDC的2019-nCoV檢測標準，以經授權實驗室推定2019-nCoV的檢測，但要遵守本授權的條款。我已經得出結論，在符合CDC 2019-nCoV測試標準的個人中緊急使用CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷小組符合該法案第564（c）節中頒發授權的標準，因為我已經得出結論那：1。 2019-nCoV可能會對感染該病毒的人類造成嚴重或威脅生命的疾病或狀況，包括嚴重的呼吸道疾病; 2。根據FDA可獲得的全部科學證據，有理由相信CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷小組可以有效診斷2019-nCoV感染，並且CDC 2019-當用於診斷2019-nCoV感染時，nCoV實時RT-PCR診斷麵板超過了此類產品的已知和潛在風險;和3。除了緊急使用CDC2019-nCoV實時RT-PCR診斷麵板來診斷2019-nCoV感染外，沒有足夠的，認可的和可用的替代方法3.II.根據該法令第564（d）（1）條，我得出的結論是，本授權的範圍僅限於授權實驗室使用授權的CDC 2019-nCoV實時RT-PCR DiagnosticPanel進行推定檢測2019-nCoVin符合CDC標準的2019-nCoV測試人員
授權CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷試劑及方案
CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷方案用於推定檢測上下呼吸道標本中的2019-nCoV RNA（例如鼻咽或口咽拭子，痰，下呼吸道抽吸物，支氣管肺泡灌洗液和鼻咽洗液/吸出物或鼻吸出物），以及其他符合CDC標準的2019-nCoV測試人員采集的樣品。測試程序包括使用授權提取從人類標本中提取和純化核酸方法/儀器，然後進行實時RT-PCR，其中RNA被反轉錄成cDNA，然後使用引物對進行擴增，並使用特異性探針進行檢測。實時逆轉錄酶（RT-PCR在FDA批準的Applied Biosystems 7500 Fast上進行帶有SDS 1.4軟件的Dx實時PCR儀器或其他授權儀器軟件。
CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷方案包括以下材料或其他授權材料：
- 2019-nCoV_N1、2019-nCoV_N2和2019-nCoV_N3小瓶包含靶向核衣殼（N）基因, SARS樣冠狀病毒的檢測以及2019-nCoV的特異性檢測引物和探針.
- RP小瓶，其中包含針對人的內部對照引物和探針RNase P基因·
- nCoVPC小瓶包含用於分析的2019-nCoV陽性對照
CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷方案還需要使用其他未包含在測試中但經過授權的授權材料和授權輔助試劑常用於臨床實驗室，並在CDC 2019-nCoV授權中進行了描述實時RT-PCR診斷麵板使用說明。CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷麵板需要以下控製材料或其他授權的控製材料；下麵列出的所有控件都必須產生預期的結果才能使測試被視為有效，如CDC 2019-nCoV實時概述中所述
RT-PCR診斷方案使用說明：
- 人體標本控製（HSC）：用作細胞培養的人類細胞培養製劑RNase P引物和探針組的提取對照和陽性對照在每次樣品提取運行中同時進行提取和測試。
- 2019-nCoV（nCoVPC）的陽性對照：對每批樣品進行分析。監視rRT-PCR試劑的失敗和反應條件。
- 無模板對照（NTC）：每次運行均包含無核酸酶的水。監控試劑和係統汙染。
- 臨床樣品中的RNase P（RP）對照：RP引物和探針組包含在每次運行都要測試人RNase P，以控製樣品質量和證明核酸是通過提取過程生成的。
上麵標記的CDC 2019-nCoV實時RT-PCR診斷方案與FDA授權的標簽一致，標題為“ CDC 2019-Novel Coronavirus”（2019-nCoV）實時RT-PCR診斷方案使用說明”（可從以下網站獲得）https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-useauthorizations.
附3
微量總 RNA 提取試劑盒及方法, 根據Huang C 等(Lancet. 2020 Jan 24) 方法改編
微量總 RNA 提取試劑盒(另需購買本公司TRIZOL裂解試劑)
Catalog No. TR206-50 (50 次反應) 或TR206-200 (200 次反應)
TRIZOL等類似試劑裂解
試劑盒組成: 洗滌液 1, 第一次使用前按說明加指定量乙醇 (無水乙醇, 95-100%）;RNA 洗滌液 2, 第一次使用前按說明加指定量乙醇; RNase-free H2O 室溫 6 ml; 1 號柱, 收集管（2ml）
特性:
1. 樣品來源：TRIZOL等類似試劑裂解的樣品。
2. 樣品範圍：≥17核苷酸。
3. RNA純度：高質量的RNA可應用於高通量測序等敏感的下遊實驗。
4. RNA結合量：每個柱子可最多結合10μg的RNA。
操作步驟:
以下離心力如無特殊說明均在10,000-16,000 x g範圍內離心1分鍾。
（I） 樣品裂解勻漿 此步驟主要參考TRIZOL等類似裂解試劑說明書的裂解液用量，以下給出我公司提供的可完美替換 TRIZOL的TRIcom試劑用量作為參考
1)全血樣品：直接取1體積的液體樣品，加入3 倍體積裂解液（推薦100μl全血加入300μl以內），充分振蕩並 且混勻。
2) 洗鼻液，漱口液離心棄上清，細胞沉澱加300μlTRIZOL裂解液.
（ I I）樣品純化：
1. 加入等體積(95-100%)的無水乙醇到上一步TRIcom或TRIZOL裂解液中混勻。
2. 將上述混合物放入套在收集管內的1號柱裏，離心1分鍾。去除濾出液。
3.添加400μl的RNA洗滌液2到1號柱裏，離心1分鍾。去除濾出液。
4. 添加400μl的RNA洗滌液1到1號柱子裏，離心1分鍾。去除濾出液。
5. 添加700μl的RNA洗滌液2到1號柱子裏，離心2分鍾以免洗滌液殘留。
6. 取出1號柱，放入一個無RNA酶的離心管中，在吸附膜的中間部位加10-15μl RNase-free water（事先在 65-70℃ 水浴中加熱效果更好）， 室溫放置2分鍾， 離心1分鍾洗脫RNA。
(北京天漠科技開發有限公司 Tel: +86-10-58235289 · Web: www. tianmobio.com)
