二維薄層色譜應當滿足兩個條件：
1）兩個維度的分離機製是相互正交的；
2）在第一維中已被分離開的兩個物質在第二維展開的過程中依然是分離的。2D-TLC在擴充峰容量提高分離效果的基礎上，幾乎保留了一維色譜的所有優點：采用一次性固定相，樣品通常無需淨化精製，節約分析成本和時問；結果可視化；所需展開劑量少，節約試劑；固定相和流動相選擇範圍廣；所有斑點貯存在薄層板上，可隨時對其重複掃描檢測，得出最佳結果。二維2D-TLC最常用的模式有兩種：1）單固定相二維薄層色譜
單固定相二維薄層色譜 (2D—TLC on one absorbent)，即薄層板隻有一種固定相塗層。樣品在薄層板的一角點狀點樣，在第一個方向上展開， 晾幹之後，旋轉90。，在第二個方向上再次展開。為達到較好的分離效果，一般可選擇中等極性的固定相，並在兩個方向上使用不同的溶劑係統，使兩個維度分別為正相展開係統和反相展開係統。當然，理論上也可以在兩個維度上都使用相同的展開係統，但這樣隻是相當於延長了展距，對分離效果並無明顯的提升，因此較少被采用。
這裏存在著一個問題，由於兩次展開都在同一塊薄層板上進行，因此第一維所使用的展開劑很可能會對固定相的性質造成一定的影響，為了避免這種情況的發生，在兩次展開之間的流動相去除步驟十分關鍵。倘若第一維展開劑中含水，則幹燥過程將十分耗時，且很難控製薄層板的含水量，故建議將含水展開劑放在第二維，以確保方法的重現性。
以百裏香油的TLC為例，1D-TLC分離效果：
流動相：甲苯和乙酸乙酯（97.5：2.5v / v）。（a）茴香醛 - 硫酸試劑和（b）乙醇-香草醛。
百裏香油2D-TLC分離效果：
Thymi Oleum化合物的2D-TLC分離
2） 雙固定相二維薄層色譜
雙固定相二維薄層色譜 (2D—TLC on bilayer plates)，即薄層板鋪有兩種不同的固定相塗層，一種塗層為一窄條帶，薄層板的剩餘空間鋪滿另一種塗層。樣品在條帶塗層的一端點狀點樣，在第一個方向上展開，晾幹之後，旋轉90。在第二種塗層上進行展開。第一維固定相還能起到預濃縮的作用，使第二維展開的條帶更細，展開結果更為美觀。
雙固定相二維色譜也和單固定相二維色譜存在著相同的問題，即兩次展開過程之問的幹燥問題，但其問題更為嚴峻，單固定相二維色譜尚可選擇將反相係統在第二維展開，但雙固定相二維色譜的兩個維度已被預製，第一維若為十二烷基矽膠之類的固定相，則隻能選擇將反相展開係統作為第一維，無法回避控製含水量的問題。
除了分離，2D- TLC還可以用來確定化合物在二氧化矽上是否穩定。2D- TL常規使用步驟如下：
1. 將TLC板切成方形。良好的尺寸是7厘米x 7厘米，但請確保它首先適合您的溶劑容器
2. 將用於色譜柱的溶劑倒入玻璃容器中。溶劑應該是2-3毫米深，這樣斑點樣品不會浸沒。這確保了樣品不會溶解到溶劑中並隨著溶劑向上移動到TLC板上。
3. 使用毛細管將樣品“點”到左下角的板上（a）。該點應距離底部和左側邊緣約0.5-1厘米，直徑1-2毫米。
3. 將TLC板放在容器中。不要移動或打擾板或TLC容器，因為這會導致溶劑中的波紋和溶劑的不規則。當溶劑前端距離板頂部0.5-1 cm時，用鑷子小心地從容器中取出板。
4. 讓溶劑蒸發。將板旋轉90°，使原始樣品點位於右下角。組分斑點將沿著板的底部形成水平線（c）。
5. 將TLC板放回容器中。當溶劑前端距離板頂部0.5-1 cm時，用鑷子小心地從容器中取出板。
6. 讓板上的溶劑蒸發，然後使用UV燈或高錳酸鉀浸漬使板可視化。
7. 用鉛筆標記所有斑點的位置。從樣品被點樣的角落，通過樣品點，到對麵的角落畫一條對角線。在二氧化矽上穩定的化合物將出現在對角線上。如果化合物在二氧化矽上分解，其斑點將低於對角線。
如果您發現您的化合物在二氧化矽上不穩定，請考慮使用氧化鋁或其他純化技術，如結晶或蒸餾。也可以推遲純化化合物並將整個樣品帶到序列中的下一步。根據下一步反應，您的化合物可能會轉化為對二氧化矽更穩定且更易於淨化的物質。
