中文名稱: 葡聚糖凝膠 LH-20;其他名稱:交聯葡聚糖凝膠LH-20;交聯右旋糖酐凝膠LH-20
英文名稱:Sephadex LH-20;Cross-inked dextran gel LH-20
可用於分離膽固醇,脂肪酸,激素,維他命,天然產物等。
結構成分:交聯右旋糖酐
顆粒直徑:18~111um
操作溫度:4~40℃
性狀:白色珠粒或粉末,屬親脂性凝膠。是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成,屬於分子篩凝膠
用途:生化研究。適用於凝膠過濾,天然產物在有機溶劑中的純化。例如:類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等
Sephadex G型葡聚糖凝膠隻適合在水中使用,Sephadex G-25羥丙化後就是Sephadex LH-20。此君既有分子篩作用,在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高,但由性能頗佳,可再生利用,所以倍受欽睞。此外上柱樣品損失很少,對處理小樣品較好,這也是我們實驗室常用的原因之一。
Sephadex LH-20適合用於天然產物在有機溶劑中的純化,可非常經濟的大規模製備各種天然產物,尤其在中藥有效成分提取中作為大孔吸附樹脂解析物的純化。
結合凝膠過濾﹑分配色譜及吸附層析於一身,能分離結構相近的分子。因此使用中要考略幾種色譜的作用機製。
最高載量可達250mg樣品/ml凝膠。建議初次上樣量控製在1-2%的床體積,視分離情況可以逐步增加;柱高的選擇也與分離要求相關――難分物質要有一定柱高和流速控製;流動相可參考TLC的條件,正確的流動相可以提高分離度並縮短分離時間。
流動相的常用溶劑為:水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷
上述溶劑的極性依次降低,對帶有極性的被分離物而言,保留值和分離度依次遞增;同理選用的凝膠柱高可依次降低,流速可以增大(或上樣量可以增加,樹脂體積在低極性溶劑中明顯收縮)。
需要考慮溶劑的溶解性,極性,沸點,毒性。
二氯甲烷通常對被分離物質間的極性和堿性差異比較小時采用。甲醇通常對帶環狀(包括苯環)物質分離采用,葡聚糖凝膠對環狀物質有強烈吸附。
使用方法:將幹粉浸泡於60—70%乙醇中過夜(充分攪拌),洗去可能存在的殘留物,抽幹然後濕態裝柱,動態用一倍柱體積的60—70%乙醇淋洗,再用水洗淨乙醇即根據自己選用的流動相體係平衡、上樣
Sephadex LH20的分離原理是根據分子大小,主要有兩方麵:以凝膠過濾作用為主,兼具反相分配的作用(在反相溶劑中)。因為凝膠過濾作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脫下來,小分子的化合物保留強,最後出柱(具體原理可參見分子篩層析)。如果使用反相溶劑洗脫, Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用,所以極性大的化合物保留弱,先被洗脫下來,極性小的化合物保留強,後出柱。如果使用正相溶劑洗脫,這主要靠凝膠過濾作用來分離。
Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類:反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫,以甲醇/水係統最為常見,先用水,逐漸增加甲醇比例,最後用100%甲醇衝柱。正相係統以氯仿/甲醇最為常見,先用50%氯仿/甲醇,逐漸增加甲醇比例,最後用100%甲醇衝柱。
如果樣品極性大,就選用反相溶劑洗脫(甲醇/水),樣品用最少體積的甲醇/水(盡可能甲醇少一些)溶解,過濾後,濕法上樣。如果樣品極性小,這選用正相溶劑洗脫(氯仿/甲醇),樣品用最少體積的氯仿/甲醇溶解,過濾後,濕法上樣。
(1) 分離時流速不可太快,切切不可心急,所謂欲速則不達;接餾分時可開全速,節省時間。
(2)柱子盡可能長, Sephadex LH20 柱長的增加將極大地改善分離,所不要吝惜填料,寧可將填料全裝在一根大柱子中,不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優勢兵力,打擊敵人。
(3) 餾分一定要接的細,可1/10,或1/20 個保留體積接成一餾分。
(4) 洗脫體積一般為2-3個保留體積,對特殊保留強的化合物,可洗脫5個保留體積。
(5)鞣質成分死吸附嚴重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣質
(6)Sephadex LH20 對黃酮類成分的分離效果極佳,方法很成型,有大量文獻參考。
(7)填料反複使用,每次用完,一般可用甲醇將柱子洗幹淨,然後用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來,待用。暫時不用時,可以水洗→含水醇洗(醇的濃度逐步遞增)→醇洗,最後泡在醇中貯於磨口瓶中備用。如長期不用時,可在以上處理基礎上,減壓抽幹,再用少量乙醚洗淨抽幹,室溫充分揮散至無醚味後,60~80°C幹燥後保存。