沙眼病原體的發現

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沙眼病原體的發現

沙眼是一種古老的眼病, 世界性廣泛流行, 曾是致盲首因, 嚴重危害人類健康。自 19世紀初, 沙眼病原問題即受到微生物界、眼科學界極大重視。

記得80年代中期讀研究生時隨導師出門診，某天我在門診手術室一上午做了5台眼科小手術，完了跟導師說：今天有點累了，做了5台手術。導師說：做這麽幾台小手術就叫累呢？想到解放初期，在同仁醫院做住院醫那幾年（49-52年），在門診上班，我幾乎每天都要做20幾台倒睫矯正術……..

研究曆史

人類沙眼最早的記錄起始於公元前3400 年, 即埃及的基輔 ( Khefu)時代, 當時有記載關於沙眼臨床症狀的描述即倒睫症。沙眼( trachoma) 來源於古希臘語/ 粗糙, 即上瞼淋巴濾泡。公元 11世紀阿拉伯醫生IbncIsa認為沙眼分為 4 期, 並指出倒睫是沙眼的主要並發症, 稱之為埃及眼炎。 1789至 1801年, 拿破侖率領法國軍隊進攻埃及歸來時, 法國士兵將從埃及染上的這種疾病帶入歐洲, 隨後英國士兵又將該病帶入英國。同樣, 通過移民途徑, 這種疾病又傳入了美洲大陸。 1905年, 美國國會批準的修正案中規定移民進入美國前所有人都需要接受沙眼的檢查[ 1] 。除了這種疾病的傳染性強之外, 其與貧窮、居住擁擠、衛生條件差、缺乏足夠的水源供應有關 [ 2]。

在我國沙眼也是一種古老的眼疾, 最早記載開始於黃帝內經, 古時稱為/ 粟瘡, 又名椒瘡, 明朝哀學淵的眼科全書記為/ 瞼生風粟, 即/ 瞼間積血, 年久致成風粟, 與眵粘症同, 然瞼眵粘睛, 無風粟也, 故此分瞼生風粟, 蓋胞者上胞, 瞼者下瞼也。在審視瑤函等眼科書中有粟瘡者, 似瘡非疹, 翻開上瞼, 細顆業聚, 生於瞼內, 如楊梅之狀, 其肉與粟米相似, 赤白不定, 多淚難睜。至於治療方麵, 眼科龍木論、目經、銀海精微等書記載有利用刀間日鏟洗出血, 三、五度, 去根本即癢, 照本症點服不輟, 漸自稀疏 [ 3]。 20世紀 50 年代, 當時沙眼流行範圍很廣, 據世界衛生組織估計, 當時全世界有超過六分之一的人口患沙眼, 在發病率高的地區, 人口中因該病而失明的超過 1% ,視力受到嚴重損害的超過 10% 。據當時的調查, 我國的城市沙眼患病率約 25% ~ 30% , 農村沙眼患病率高達 80% ~ 90% , 有十人九沙之說, 其危害可想而知[ 3] 。早期無法解決沙眼問題主要是由於未查明病原體, 因此很多學者針對沙眼病原體進行研究, 主要有 3 種學說, 即病毒、細菌及立克次體感染。 1907年, 細菌學家Halberstaedter和 von Prowazek在印度尼西亞爪哇地區研究發現沙眼患者的結膜上皮細胞內有所謂包涵體存在, 在姬姆薩染色下上皮細胞質呈青藍色, 內藏不規則的圓形深藍色顆粒體, 典型的聚集成堆, 像帽子似的覆蓋在細胞核的一端。在病變的過程中, 這些藍色顆粒逐漸消失, 為紅色的較小顆粒所代替, 推測這種包涵體就是沙眼的病原體。1910年, Lindner在沙眼患者刮下的組織中發現一種較大的兩極深染的藍色小體, 有的遊離在細胞外, 有的在細胞內, 最大的可達到 1微米, 命名為始體 ( Initial body )。細胞內包涵體小時, 則多為少數的始體, 細胞內充滿包涵體時, 則多為原體 ( Elementary body) [ 3] 。 1912年 Nicolle等研究證明沙眼的病原體是可以過濾的。他們采用改良的BerkefeldV濾器, 把沙眼患者的刮取物過濾, 再將濾液接種在猴眼, 使猴患上沙眼後, 又接種在一位已盲目的自願者眼中, 結果這位被接種者也患上了沙眼, 由此得出結論: 沙眼的病原體是一種可過濾的病毒。該結果在 1935年由 Thygeson和 Proctor重新做了濾過實驗, 即將沙眼患者刮下的物質研碎, 用火棉膠膜濾過, 將濾液接種在猴子眼內, 結果這隻被接種的猴子患上了沙眼, 結論得以證實。同年, 他們與 Richards從患嚴重沙眼的印第安小孩的眼內, 刮下上皮並研碎, 破壞細胞膜後, 先用普通的粗濾紙過濾, 除去細胞碎屑, 之後再用直徑 0. 6 微米小孔的火棉膠膜過濾, 將濾液分成 3份: 第 1份接種在血瓊脂等培養基上, 結果為陰性, 無微生物生長; 第 2 份用離心機離心後, 取上清塗片檢查, 經姬姆薩染色, 可找到很多沙眼原體; 第 3份接種於一位 50歲女性自願者的正常眼, 先將結膜刮擦, 滴入約 1. 6 毫升濾液, 再輕輕摩擦結膜, 經過 5 天潛伏期後, 該婦女患上一種急性結膜炎, 並有大量包涵體和遊離始體存在, 診斷為沙眼。 6 周後, 該女性患者角膜有典型血管翳, 結膜變化和臨床經過均為典型的沙眼, 經 1年多治療才痊愈。其後又有很多的實驗證實沙眼的病原體是一種可過濾性病毒 [ 4] 。

1938年 Thygeson檢查了 320例沙眼患者, 共分為 10組 (表 1), 發現在沙眼開始時 100% 可以找到包涵體, 於急性期多為原體, 並且原體的數量與疾病的輕重成正比, 而在沙眼的後期包涵體的發現率明顯減少。 1951年日本學者伊藤報道用電子顯微鏡檢查沙眼組織中取得的濾過液, 可見很多小體, 大小約 60~ 250 納米, 5人接種該濾液, 其中 4 人感染沙眼, 因此有關沙眼的病原體被認為是濾過性病毒, 但是也有實驗得出了陰性結果。 1927年日本眼科學家野口英世在新墨西哥從 5 個未經治療的印第安人沙眼患者中分離出一種多形態的杆菌, 該菌微小而不產生芽孢, 有莢膜, 能運動, 有鞭毛, 革蘭染色陰性, 長約 0. 8~ 1. 2 微米, 一端有一根鞭毛, 為兼氧性, 在半固體培養基中, pH 值 7. 8, 15~ 30度下發育良好, 其培養物可引起猴和猿的顆粒性結膜炎。由於這些細菌可引起人和動物發生類似沙眼的濾泡性結膜炎, 所以野口英世認為這種顆粒性杆菌是沙眼的直接病原。但是, 後來經過各國專家的 74 次反複實驗均先後否定了野口氏顆粒性杆菌為沙眼病原體的觀點, 原因是這種細菌接種在喉咽後, 雖然引起濾泡性結膜炎, 但是無瘢痕化, 並且不是每個患者中都能找到該細菌。

1934年 Thygeson曾證明包涵體和立克次體有相同的性質, Busacca認為沙眼病原體是立克次體, 定名為 R ickettsiatrachomatosa, 主要是形態學相似。Cuenod等用二期沙眼的顆粒內容移植在冰箱內保存 2 天、於無菌狀態下孵化的虱, 應用 Carrels穿刺接種法, 4 天後將該虱磨碎, 用生理鹽水中作成乳劑注射在一位盲人的結膜下, 5 天後該患者即發生黏膜肥厚和細小的顆粒, 其表皮刮片和淚液中有點狀和小帽狀的包涵體和遊離的立克次體。6周後, 結膜呈現典型的第 1期沙眼症狀 (未提及以後是否發生瘢痕和角膜變化 )。但是, 此後很多學者使用同樣的培養方法, 結果則為陰性, 從而否定了立克次體是沙眼病原體之說。

20世紀早期眼科學家、細菌學家及病理學家都參與了對沙眼病原體的研究, 以包涵體、顆粒杆菌及立克次體為主要發現, 但是經過無數的實驗和探索, 始終未能解決問題。由於在世界各地都很難找到野口氏顆粒性杆菌, 而實驗的結果又多不確實, 尤其是以人類接種但並未出現沙眼的情況, 因此之後無人再探討。立克次體也因為虱的接種不能完全成功, 而沙眼患者的威-斐反應與其他已知的立克次體疾患相差太遠, 所以也被人放棄。僅包涵體學說仍被學者們認可, 但是包涵體究竟是何物, 生物還是非生物? 若是生物, 則是否為一種特別的生物? 抑或濾過性病毒或立克次體?

沙眼病原體的發現

20世紀 30年代, 我國微生物學家湯飛凡看到沙眼對國人的危害, 即已開始了沙眼病因的研究。他和眼科周誠滸教授合作從 227例沙眼患者取材, 做了數百次細菌培養, 均未能分離出顆粒杆菌。采用野口原顆粒杆菌菌株接種 12名誌願者 (包括湯飛凡自體眼 ), 但是人體感染試驗無沙眼病變,猴眼感染實驗也為陰性結果; 以顆粒杆菌為抗原做凝集試驗發現沙眼患者與非沙眼患者無差別; 因此湯飛凡教授否定了沙眼病原的細菌學說。此後, 由於日本侵華戰爭的影響, 中斷了我國沙眼研究的進程。

中華人民共和國成立以後國內烈性傳染病基本控製,防疫重點轉向多發、常見傳染病。當時我國沙眼流行猖獗,防治問題未能解決。湯飛凡教授計劃重新繼續開展沙眼病因的研究, 1954年他與時任北京同仁醫院眼科主任兼副院長的張曉樓教授協商共同合作, 由張曉樓教授負責臨床檢查、提供臨床標本, 湯飛凡教授主持實驗研究。他們接受前人失敗的經驗, 首先從包涵體研究入手, 因為包涵體形成是病毒等細胞內寄生的微生物感染的特征, 製定了科學的采集活動期沙眼標本的方法, 即選擇 201例活動性的、無並發症且未經治療的典型沙眼病例做結膜刮片, 帶回生物製品研究所實驗室, 經染色後於顯微鏡下檢查, 證實沙眼結膜刮片可查見包涵體。將包涵體陽性的沙眼材料接種到 1隻健康猴子眼內, 使其感染沙眼, 證明了包涵體的感染性。在猴體感染實驗中, 共接種了 6 隻猴子, 其中 3 隻獲得陽性結果。在這 3隻感染陽性的猴子中, 2隻找到了包涵體。此發現糾正了以往認為猴子患沙眼不產生包涵體的錯誤觀點 [ 5, 6]。

隨後他們開展沙眼病毒的分離實驗。根據1951年日本學者荒川報道小白鼠腦內注射、1953年北村用絨毛尿囊接種雞胚的方法分離沙眼病毒, 他們從 68例沙眼患者中采集材料, 通過不同方式接種了 2500多隻小白鼠, 觀察發病過程和病理改變, 但結果都是陰性, 實驗似乎進入了絕境。但是,湯飛凡教授認為鸚鵡熱病毒是可以在雞胚卵黃囊中生長的微生物, 沙眼病毒與其形態相似, 也可能在雞胚卵黃囊中生長繁殖, 因此決定接種雞胚卵黃囊分離病毒。他們分析了影響病毒分離的因素, 認為除了選擇敏感動物、適宜的感染途徑、慎重選擇無其他並發感染或繼發感染的沙眼病例外, 還需抑製雜菌生長。人結膜囊存在正常菌群, 如果在不除雜菌的情況下將標本接種雞胚後, 細菌將大量繁殖, 在病毒生長之前雞胚就已經死亡, 因此他們決定在標本中加入抗生素作為抑菌劑, 而當時病毒分離常采用青黴素和鏈黴素作為細菌抑製劑。隨著雞胚分離實驗的多次重複, 他們終於在 1955年 8月 18日第 8次分離試驗中分離出了 1株沙眼 / 病毒!

這是世界上第一株沙眼病毒, 被命名為 TE8, T代表沙眼,E 代表病因, 8是第 8次試驗。雖然分離出病毒, 但成功率太低, 後來才知道是因為青黴素能殺死病毒。因此, 他們改進了方法: 取消了青黴素, 加大了鏈黴素的量, 延長了鏈黴素在標本中的作用時間, 明顯提高了成功率。采用改進的方法, 使病毒分離率達到了 50%，不到兩個半月內又連續分離出 8株病毒, 證明試驗成功。後來, 許多國家的實驗室將其稱為湯氏病毒。 1956 年分離出的 TE55株作為沙眼病毒的標準株, 在全世界範圍使用。隨後他們證明病毒能在雞胚中繼續傳代, 用其感染猴能造成典型的沙眼並可找到包涵體, 能將其從猴眼裏再分離出來, 得到純培養。他們還用分級濾膜證明病毒是可過濾的, 並測出病毒顆粒直徑為 120~ 200 nm [ 7-10] 。分離出沙眼/ 病毒後, 要確認這種微生物是沙眼的病原體應按照科赫定律要求: 第一, 要能從相應的病例中分離出這種微生物; 第二, 要能在體外傳代培養出這種微生物; 第三, 所分離出的微生物要能在健康宿主中引起典型病變和症狀; 第四, 能從接種者再分離出這種微生物。根據這個原則, 此次實驗采用的是臨床未經治療的II期沙眼, 從雞胚培養獲得的沙眼病毒與沙眼患者的材料一樣能感染猴眼, 引起特異性病變, 並能在感染的猴眼中找到包涵體和重新分離出病毒, 沙眼/ 病毒在補體結合反應上與性病淋巴肉芽腫病毒有相互交叉反應, 並且沙眼病毒抗原與沙眼患者血清起陽性反應[ 11] 。

為了進一步驗證分離獲得的沙眼病原體, 湯飛凡和張曉樓教授決心做自體實驗, 以證明分離的病毒對人眼的致病性。 1958年 1月和 2月課題組分別將 TJ16 株病毒( 1957年 10月北京同仁醫院沙眼小組分離出的病毒, 經雞胚傳 9 代後保存 10周 ) 接種於湯飛凡的左眼瞼結膜內, 將 TE16株病毒 ( 1956年 9月生物研究所實驗室分離出的病毒, 經雞胚培養傳 16代後保存 18個月 )接種於張曉樓的左眼瞼結膜內。接種後逐日行眼部檢查, 記錄發病情況。結果他們的接種眼都急性發病, 表現急性濾泡性結膜炎、角膜淺層點狀浸潤, 伴患側耳前淋巴腺腫大。兩位科學家在患眼高度紅腫、充血、流淚的病況下忍受痛苦堅持從自己病眼重複取材檢驗, 先後自湯飛凡病眼結膜刮片取材查包涵體 5 次, 4次陽性, 取材分離/ 病毒10次, 2次陽性; 自張曉樓病眼結膜刮片取材查包涵體 13次, 8次陽性, 取材分離/ 病毒 8 次, 4次陽性。臨床發病和實驗檢查結果都確鑿地證實了分離的沙眼/ 病毒 0為沙眼病因。接種後 23 天、41 天, 他們才分別開始治療。張曉樓教授的左眼結膜上穹隆部從此留下了沙眼瘢痕[ 12, 13] 。 1957年由湯飛凡、張曉樓、黃元桐等署名的沙眼病毒分離成功論文在我國《微生物學報》發表後[ 8, 9, 12-14] , 震動了國際微生物學界和眼科學界。美國、英國醫學代表團來華訪問索取分離的毒株, 課題組送給 Spooner兩株凍幹保存的毒種 ( TE8和 TE55)。英國 Lister研究所沙眼研究組主任 Collier 博士將其接種雞胚複蘇了病毒, 並按照這種方法在西非岡比亞分離出 1株命名為 G1沙眼衣原體, 從此中國首次分離出的 TE8和 TE55兩株毒種被送到世界各國, 成為研究沙眼病原體的標準株。由於沙眼和鸚鵡熱及鼠蹊淋巴肉芽腫的病原體同屬介於細菌與病毒之間的一組微生物, 1973 年國際微生物學分類將鸚鵡熱-沙眼-性病淋巴肉芽腫這組長期被命名為病毒的微生物從病毒中移出, 改稱衣原體目, 沙眼病毒正式改名為沙眼衣原體 ( Chlamydia trachomatis)。從此, 世界各地不斷有采用中國的實驗方法成功分離出沙眼衣原體的文獻報道。此後每 5年世界科學界召開 1次國際性會議, 深入開展沙眼衣原體的研究。現已認識到沙眼衣原體還可引起人體其他多種部位的感染, 造成多種多樣的疾病, 如男性尿道炎、附睾炎, 婦女宮頸炎、子宮內膜炎, 嬰幼兒肺炎, 母嬰衣原體傳播等[ 15]。沙眼衣原體感染已成為一種重要的性傳播疾病, 引起醫學界的極大關注。總之, 沙眼病原體的發現是對醫學研究領域的重要貢獻, 是微生物學家和眼科學家密切合作與共同努力而創造的中國醫學史上的重要成就之一。

參考文獻

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2 M ecaskey JW, Knirsch CA, Kum aresan JA, et a.l The possibility of

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3 吳文華, 沈玉清. 實用沙眼防治學. 上海衛生出版社, 1956. 617

4 鄒子度. 沙眼的病原. 中華眼科雜誌, 1953, 3: 90-103.

5 湯飛凡, 張曉樓, 李一飛, 等. 沙眼病原研究: I. 沙眼包涵體的研究. 微生物學報, 1956, 4: 1-14.

6 湯飛凡, 張曉樓, 李一飛, 等. 沙眼病原研究: II. 猴體傳染實驗. 微生物學報, 1956, 4: 15-23.

7 李一飛, 盧寶蘭, 張曉樓, 等. 沙眼病原研究: III. 病毒分離試驗. 微生物學報, 1956, 4: 25-32.

8 湯飛凡, 張曉樓, 黃元桐, 等. 沙眼病原研究: IV. 接種雞胚、分離病毒. 微生物學報, 1956, 4: 189-210.

9 湯飛凡, 張曉樓, 黃元桐, 等. 沙眼病原研究: V. 沙眼病毒分離技術的改進. 中華醫學雜誌, 1957, 43: 81-86.