小混混得了個諾貝爾獎 - PCR 發明人的故事

看看PCR方法建立者的故事，這樣的人，估計在我們國家什麽也幹不成。
　　
　　末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、電影《侏羅紀公園》，以及辛普森殺妻案，這四件事情到底有什麽相關？答案是沒有。隻不過近十幾年來生物技術的一項新發明，把它們給連在一塊了。這項技術就是“聚合酶鏈反應”（polymerase chain reaction，PCR）。
　　
　　PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、曆史人物的殘骸，還是幾十年前凶殺案中凶手所遺留的毛發、皮膚或血液，隻要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。
　　
　　PCR的原理及做法其實不難，它利用DNA雙鏈複製的原理，將一條DNA序列不斷加以複製，使其數量以幾何級數方式增加，就可用來做定性的分析及各式各樣的應用。DNA雙螺旋結構於1953年發現，自此確立了它就是細胞裏攜帶遺傳信息的分子。第一個細胞內用來複製DNA所需的聚合酶，也早在1956年分離成功。幾十年來，在試管內複製DNA已是許多實驗室的例行工作，但就是沒有人想到以PCR 方法大量複製DNA，就算想到也不認為可行，直到1983年。
　　
　　DNA在複製時，其中兩條以氫鍵結合的互補鏈必須先行分開，才能各自作為複製的模板；而打開雙螺旋的最簡單方法就是加熱。在高溫下，雙股DNA鏈會分離成單股，等溫度降低後，互補的兩條DNA鏈又可以恢複成雙股。雖然DNA分子能耐高溫，但進行DNA複製所需的聚合酶是蛋白質，在高溫下會失去活性。這也是之前的研究人員不認為這種方法可行的原因之一。再有，要在千萬條DNA當中，以一小段已知序列製成的引物，“釣”出所需的片段，進行複製，也跟大海撈針差不多，這是另一個讓人卻步的理由。
　　
　　PCR的發明人，一般公認是穆裏斯（K. Mullis），他也因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。穆裏斯在好些寫作中，包括1990年在《科學美國人》上的一篇文章，及1998年的自傳《心靈裸舞》（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR這個構想的起源。然而，PCR從構想到實現，真的就是穆裏斯一人之功嗎？PCR究竟是在什麽樣的環境下誕生的呢？
　　
　　穆裏斯的出身是生物化學家，1972在加州大學伯克利分校取得博士學位，專長有機合成。一早他就表現出桀驁不馴的性格，在那嬉皮的年代，吸食自製的迷幻藥不算太稀奇，穆裏斯也樂於此道。更讓人難以想象的是，他在經曆迷幻藥之旅的過程中，居然想出了某個解釋大爆炸宇宙學的理論，寫了出來投稿到《自然》周刊，居然登了出來。他也因此通過了博士資格考，因為有文章發表在《自然》周刊的教授已然不多，學生更是少見。至於他的博士論文，也是用“帶點幽默的口語化寫成 ”（穆裏斯自己的說法），要不是寬容的指導老師幫他講話，隻怕要重寫。
　　
　　穆裏斯另一個毫不掩飾的愛好是女人，這也給他的生涯帶來許多轉折。博士學位到手後，他隨著新婚的第二任妻子來到堪薩斯州，因妻子的關係進了該州的醫學院就讀，他也在那兒的心髒科找到與其學位並不相稱的工作。不久他就感到厭惡，因為實驗需要宰殺許多老鼠。1975年，他與妻子仳離，又與後來的第三任妻子回到加州灣區，在第一任妻子所有的一家糕餅店當了近兩年的經理。1977年，才又回到舊金山加州大學醫學院的藥物化學實驗室，走的仍然不是學術的正途，也同樣在不久以後，對新工作感到厭煩。
　　
　　1979年，穆裏斯進了灣區一家名叫“西特斯”（Cetus）的私人生物技術公司任職。當年，生物技術公司還處於萌芽階段，很少學術界人士願意離開象牙塔的庇蔭到私人企業工作。就算是到有規模的大藥廠，同樣也得不到多數同行的認可與祝福，認為是學術生涯的終點。然而西特斯卻是一個極為特殊的所在，這家公司集結了一批有能力、有夢想的科學家，在自由開放的風氣下，共同朝既定的目標前進。這和一般學院裏各大教授及實驗室的主持人關起門來各行其是的做法，相當不同。西特斯聘用穆裏斯，是想借重他有機化學合成的專長，負責合成寡核苷酸（短鏈的DNA分子），以供實驗所需。
　　
　　自1970年代起，由於發現選擇性切割DNA分子的限製性內切酶及接合酶，可將DNA分子加以重組，因此引發了基因工程的開展，才出現生物技術這個產業。於是，西特斯公司從1970年代以製造維生素及抗生素為主的公司轉型，進入1980年代以基因產品為主的研發。生長激素、胰島素、凝血因子、幹擾素、白介素等，都是西特斯的研發對象。1981年，西特斯正式成為上市公司，籌措到大筆資金。 
　　穆裏斯就是在這股氛圍下進入西特斯的。其實他做的工作，不算什麽研究，隻是設法改進寡核苷酸合成的效率而已。穆裏斯花了很多時間玩當時剛流行的個人電腦（還不是IBM的），也經常提出古怪的想法，其中大部分都是錯的。他爭強好鬥、不接受批評的個性，也令他到處結怨。他在工作單位與異性的關係，更惹出許多麻煩，甚至要勞動主管出麵解決。1981年，他升任寡核苷酸合成部門的主管。為了提高產量及節省時間，他省略了品質管理的步驟，引起使用單位的不滿，聲稱品質不佳的寡核苷酸使得他們的研究出現問題，穆裏斯則反擊說是使用單位本身的能力不足所致。 　　
　　PCR的點子，也就是在這樣的情況下誕生的。根據穆裏斯自己的說法，那是在1983年春天的一個周五晚上，他開車帶著女友前往鄉間的小屋度周末。在蜿蜒的鄉間公路上開著車，一段DNA反複複製的景像，在他的腦海裏冒了出來。穆裏斯原以為這樣簡單的想法，應該有人提出過，但搜索文獻後卻發現沒有。在“頓悟” 之後的三到五個月間，穆裏斯並沒有任何行動，原因如今也不清楚。該年8月，穆裏斯首次在公司裏正式作了有關PCR原理的報告，聽者反應冷淡。一來，大家已經習慣了他的胡思亂想；再者，多數人的想法是，這個原理太簡單了，如果可行的話，一定早有人做過，否則，裏頭一定有它不可行之處，但也沒有人明確說得出來，為什麽不可行。 　　
　　於是，穆裏斯得著手證明這個構想的可行性。從1983年9月起，穆裏斯陸續進行了一些實驗，換過幾個DNA模板，也嚐試不同的加熱、降溫周期，結果都不夠肯定，頂多隻在電泳凝膠上形成一條若有若無的線條，未能說服旁人PCR發揮了增幅的功效。1984年6月，穆裏斯在公司又因男女關係惹出事端，引起眾怒，瀕臨被開除的命運。結果是引薦他進入公司的上司為他說情，隻免除了他的主管職務，並予轉組，同時限定他在一年內把PCR建立起來。 　　
　　任何研究方法從概念提出到實際應用之間，所需投入的精力與時間，大多為一般人所低估。由於穆裏斯本身沒有分子生物學的訓練，公司派了技術員協助，前後一共有三位。這些人在PCR的發展上，發揮了重要的作用。1984年11月，穆裏斯的技術員首次取得可信的結果，證明了PCR的可行。於是在1985年初，公司決定讓技術精湛的日裔技術員才木（Randall Saiki）加入工作，這是一項正確的決定。在自動化的儀器出現之前，PCR是個勞動密集型的實驗方法，需要長時間的反複操作，手腳不利落的人是做不來的。才木的結果則幹淨漂亮，讓人無從置疑。 　　
　　到了1985年春天，西特斯的高級主管已經對PCR的潛力信服，也開始擔心消息外泄（穆裏斯自己是個大嘴巴），而讓旁人取得先機。3月裏，他們送出了第一個專利申請，也準備在10月舉行的美國遺傳學會年會上報告成果，但之前必須將正式的論文寫好投送才保險。他們決定寫兩篇文章，一篇關於PCR的理論，由穆裏斯執筆先行發表，第二篇則集中在PCR的應用上，以才木的實驗結果為主，隨後推出。結果整個夏天，穆裏斯都在玩電腦，一再拖延論文的寫作。到9月下旬另一篇應用文章寫好投送時，穆裏斯還沒有動靜。因此，第一篇提到PCR這個方法的論文，於1985年12月20日發表在《科學》周刊上，共有七位作者，才木排頭名，穆裏斯則排第四。 　　
　　到了該年12月，穆裏斯才將論文寫好，並投給《自然》周刊。但穆裏斯忘了附上一封給編輯的信，當然也就沒有說明該文與《科學》周刊上的那篇有何不同，結果遭到退稿。震驚之餘，他轉投《科學》周刊，並由西特斯的主管幫助寫了封信給編輯，結果仍然遭到退稿。這時，穆裏斯把怒氣轉向公司，認為那是公司的陰謀，想要竊取他發明PCR的功勞。科學發明的優先權及功勞之爭，科學史上可謂不絕於書，也常是公婆都有些道理，不細察背景與經過，隻憑後人記載的片言隻語，是很難了解真相的。至於PCR的概念是穆裏斯的結晶，沒有什麽人有異議，隻不過將概念實現的過程，就複雜得多了。
　　
　　穆裏斯的文章兩度遭退稿後，公司裏有人建議投給《酶學方法》（Methods of Enzymology），主要是因為有人與該刊主編吳瑞相熟，較好溝通，同時PCR的性質也適合該強調方法學的刊物。於是，穆裏斯的文章終於得到發表，隻不過整整晚了一年，到1987年初才問世。這篇文章隻有穆裏斯及另一位技術員兩人掛名。
　　
　　為了表示他們並無意爭功，西特斯的主管向冷泉港實驗室的沃森（DNA雙螺旋結構的發現人之一）推薦穆裏斯在1986年5月舉行的“人類分子生物學”專題研討會中，報告PCR的原理及實際應用結果。這是穆裏斯生平第一次受邀演講，分子生物學界有頭有臉的人也都在場。結果他表現不錯，建立了往後人們的印象：PCR是穆裏斯一手發明的。冷泉港專題研討會的專刊於1986年底出版，還在《酶學方法》的文章之前，穆裏斯掛頭名。
　　
　　自此，PCR之名及其強大的應用性就廣為人知了。然而，將PCR變成真正成熟技術的臨門一腳，則是耐高溫DNA聚合酶的引進。
　　
　　先前提到，PCR的操作過程中，需要反複加熱與降溫的步驟，而前一次循環所使用的大腸杆菌DNA聚合酶在高溫下就變性了，因此在每一次冷熱循環之後，都要加入新鮮的聚合酶。這個做法不但煩瑣，並且昂貴。按當時的價格，一次循環所需的聚合酶值1美元，30個循環下來就是30美元，循環更多次就更不得了。因此，1986年春，穆裏斯首度提出使用耐高溫酶的想法。經過文獻搜尋，果然找到了兩篇有關文獻，較早的一篇是在美國做的，另一篇則是俄國科學家的成果，以俄文發表。
　　
　　第一篇報道分離耐高溫DNA聚合酶的工作，是一位來自台灣的年輕科學家初試啼聲之作。1973年，錢嘉韻隨著留學熱潮到俄亥俄州的辛辛那提大學生物係就讀。她的指導老師崔拉（J. Trela)對一種黃石公園的熱泉裏發現的嗜熱菌（Thermus aquaticus）感到好奇，就讓錢及另一位美國學生以該細菌為論文研究的主題。在另一位老師的指導下，錢學會了從細胞中分離蛋白質，成功分離出該細菌耐高溫的Taq DNA聚合酶。
　　
　　1975年獲碩士學位後，錢轉往衣阿華州立大學取得神經生物學博士學位，1982年回到陽明醫學院神經科學研究所任教，至今已滿20年。那篇曆史性作品，發表於1976年的《細菌學雜誌》（Journal of Bacteriology），她是第一作者，隻不過用了英文名字Alice，再加上她後來掛了夫姓（Chang），以至沒有太多人知道，該篇被廣為引用的文章的作者A. Chien就是錢嘉韻。
　　
　　穆裏斯雖然提出將Taq DNA聚合酶應用到PCR的建議，但當時並沒有現成的可用，他得想辦法自己分離。西特斯有全套分離蛋白質的裝備，也有人願意指導，但穆裏斯是個拖延成性的人。等了幾個月後，公司其他人隻有自己動手，按著先前錢等人發表的步驟，三個星期就分離出純化的Taq DNA聚合酶。1986年6月，才木首度將其應用於PCR，效果就好得驚人，可說是一戰成功。Taq DNA聚合酶不但大大簡化了PCR工作，同時專一性及活性都比之前使用的酶更強，背景雜訊也幾乎都消除了。自此，PCR取得了完全的成功。
　　
　　穆裏斯與西特斯的關係此後更加惡化，他完全不認為自己在發表文章的過程中有任何疏失，並要求未來五年內有關PCR發表的文章，都由他掛頭名。他還在公開場合批評公司其他人士。終於，穆裏斯於1986年9月離開了西特斯。西特斯給了他五個月的薪水及一萬美元獎金，但按產業慣例，PCR的專利權屬於西特斯公司。
　　
　　離開西特斯後，穆裏斯繼續擔任過一些生物技術公司的顧問，但再沒有發表過一篇正式論文。以他的說法，PCR就是他一人發明的，得了諾貝爾獎的肯定後，也更聽不到太多其他的聲音。1991年12月，霍夫曼羅氏藥廠據稱以三億美元購得了西特斯的PCR技術專利，西特斯公司也走進了曆史。直到最近幾年，由於之前錢嘉韻等人已經發表的工作，Taq DNA聚合酶的專利權遭到挑戰，連帶使PCR的專利也受到影響，不過那又是另外一個故事了.

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• 謝謝分享。 -pink俠- ♀ (0 bytes) () 09/19/2012 postreply 18:06:13