RACE法克隆全長基因cDNA的幾個實戰心得

RACE法克隆全長基因cDNA的幾個實戰心得

 

1， RNA質量

盡管手冊上有強調，但要多高的質量呢？其實隻要用普通的瓊脂糖電泳檢查一下就足夠：量足沒有彌撒的小分子就OK了。至於是否一定要用mRNA, 倒是不一定，至少對我的幾個基因而言是如此。

 

2，起始RNA的量

用NANO測其A260/280的值，得其濃度，KIT手冊上說是取1ug, 那就取1ug。不要想著目的基因的拷貝數可能很稀少，就多加RNA。這樣，其實得不償失：我一開始用大約4倍的量，結果老得到一團彌撒，即使看見了幾條主帶，大小也差不多，克隆測序後，得到一堆莫名其妙的其他序列，一個目的片段都沒有得到，鬱悶而且浪費時間和心情。記住，在這種情況下，並非越多越好。

 

3，引物的設計

手冊上說最好是用26bp長的引物。我也設計了幾對，包括26bp長的，也有用PRIMEREXPRESS(ABI的Realtime引物設計軟件) 設計的19-20bp長的引物，實際比較之下，長的引物並無任何優點：我的幾個5端片段都是用短的引物得到。不用長的，隻用好的。

 

4，目的片段的識別

一般而言，目的片段出來的時候，基本上不會有什麽雜帶。也許會淡一點，但肯定是一條，或兩條很sharp的帶。也抱著死馬當活馬醫的僥幸心理，割了N條這樣的條帶，結果NND一根都不是目的條帶。

 

5，TOUCH還是RACE1

TOUCH一般而言是能得到更特異的帶，雖然可能會有例外。如果基因數目不是很多，建議同時做TOUCH和RACE1。

 

6，還有就是要有耐心和毅力：RACE本身是很POWERFUL的，但有時如果覺得cDNA不行，就重新做一次。因為如果TOUCH和RACE1都做不出來的話，可能就是cDNA不行。至於為什麽會不行，嗬嗬，管它呢！

 

7，RACE那一套可以自己準備。分別購買，這樣就不用擔心隻能做7次了。