正文
摘要：從發黴的紅薯上和酸敗腐爛的蘋果上挑取黴變物用沙堡瓊脂培養基28℃培養2-3天，分離出幾個真菌菌株。將分離株重新進行平板劃線分離，挑取單菌落表麵的少許孢子用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行載片小培養，經28℃培養2—3天於低倍鏡下觀察，通過菌絲和孢子對分離株進行鑒定。觀察到簇生在分生孢子梗的頂端的呈帚狀分枝的分生孢子和有隔菌絲，可鑒定為青黴類菌；觀察到分生孢子梗上呈輪狀著生、具有3個分隔、彎曲的孢子，可鑒定為彎孢黴類菌；觀察到單細胞的芽殖孢子，並通過進一步的酵母菌生理生化測定，可鑒定為酵母菌。
關鍵詞：真菌；菌落；菌絲；孢子
1 前言
真菌一詞來源於拉丁文的“蘑菇”，現在真菌這一名詞的概念不僅包括蘑菇，而是代表著一個相當龐大的生物類群。什麽是真菌呢？從生物學的觀點來看，它們是一大類真核微生物，無根莖葉，不含葉綠素，不能利用無機物來製造食物，靠寄生或腐生生活，僅少數為單細胞，其餘為多細胞，大多數真菌有分枝或不分枝的絲狀體，能進行有性生殖和無性生殖。從形態上分為酵母菌、黴菌、擔子菌。
其實，真菌並不像其看起來的這般抽象，在我們的日常生活中幾乎到處都有它們的存在，我們每個人都有過接觸和不同程度的感性認識。例如釀酒、製饅頭用的酵母；酒曲的曲種（曲黴和根黴）；做豆腐乳的毛黴和紅曲黴；發酵飼料的黑曲黴；味美可口的蘑菇、木耳、銀耳、猴頭；作為中藥的神曲、麥角、蟲草、茯苓、靈芝；此外還有食品、衣物、用具等因潮濕而發生的黴；引起農作物病害的小麥鏽病等等都是真菌。
真菌與細菌的大小、形態、結構及化學組成差異很大，單細胞個體比細菌大幾倍至幾十倍，具有細胞壁，但不含細菌細胞壁的肽聚糖。有些真菌因環境條件的改變而改變形態，稱之為真菌的兩相性，如假皮疽組織胞漿菌在動物機體呈酵母菌樣。而在人工培養基上呈絲狀。
真菌不僅種類多，數量大，而且分布極為廣泛，與人類生產與生活有著極密切的利害關係。有些菌絲可引起人與畜禽疾病，有些黴菌還產生毒素，直接或間接的危害人類健康。因此，了解真菌的培養方法，認識其形態十分重要。
近年來在真菌分類方麵趨向於采用Anisworth&bisby的《真菌學辭典》介紹的分類係統。該係統認為真菌不屬於低等植物，而是屬於單獨成立的真菌界，界以下分為黏菌門和真菌門。真菌門再分為鞭毛菌亞門、接合菌亞門、擔子菌亞門和半知菌亞門。本研究從自然界分離到幾株真菌，並用真菌分類方法對其進行了鑒定。
2 材料
2.1 病料
發了黴的紅薯、酸敗腐爛的蘋果
2.2 培養基
2.2.1 沙堡瓊脂培養基
成分：蛋白腖10克、麥芽糖40克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升
2.2.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基
成分：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升
2.2.3 保存瓊脂培養基
成分：蛋白腖10克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升
2.3 器材
無菌室、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電爐、天平、鐵架台、滅菌培養皿、錐形瓶、漏鬥、試管、燒杯、膠頭滴管、石蕊試紙、接種環、酒精燈、量筒、玻璃棒、紗布、濾紙、試管塞、報紙、紮繩、標簽、溫箱、冰箱、蓋玻片、載玻片、顯微鏡、杜氏管
3 方法
3.1 真菌的分離培養
3.1.1 實驗的準備
沙堡瓊脂培養基的製備：用天平稱取蛋白腖10克、麥芽糖40克、瓊脂20克，用量筒量取蒸餾水1000毫升置燒杯中混勻，在電爐上加熱熔化，加熱過程中不斷用玻璃棒攪拌，調整PH值至5.4，倒入錐形瓶中，115℃滅菌20分鍾，傾注平板，冷卻[1]。
無菌室、接種箱的清潔：用酒精棉球將接種箱的內部全部擦洗幹淨，放入試管架、酒精燈、標簽、接種環、筆、火柴等實驗用具放入接種箱內，密封接種箱。依次打開接種箱與無菌室的紫外燈，紫外線滅菌20分鍾。
3.1.2 劃線分離培養
在酒精燈火焰下進行以下操作：
（1）從發黴的紅薯上和酸敗腐爛的蘋果上挑取黴變物用28℃培養2-3天，分離出幾個真菌菌株。將分離株重新進行平板劃線分離，挑取單菌落表麵的少許孢子用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行載片小培養，經28℃培養2—3天於低倍鏡下觀察，通過菌絲和孢子對分離株進行鑒定。
（2）
左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開20度左右的角度（角度越小越好，以免空氣中的細菌進入皿中將培養基汙染）。劃線前先將接種環稍稍彎曲，這樣易和平皿內瓊脂麵平行，不致劃破培養基。
（3）
右手持接種環，將上述黴變物分區劃線接種於沙堡瓊脂培養基平板中，劃完前一個區域後將接種環在火焰上灼燒滅菌，冷卻後與前一區域的最後一兩條折線接觸劃出第二區域，依次類推，共劃三到四個區域。劃線中不宜過多的重複舊線，以免形成菌苔。
（4） 接種完畢，在皿底上作好日期，平皿倒扣，置28℃培養2-3天。
（5） 將分離培養得到的幾個分離株用沙堡瓊脂培養基重新進行平板劃線分離，以得到純的單一的菌落。
3.2 真菌的載片培養（小培養）
3.2.1 實驗的準備
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的製備：將新鮮的馬鈴薯洗淨、去皮，（注意：發黴、變綠的不要使用。）切成薄片或蠶豆大小的方塊，稱取所需的重量，倒入鍋內，加水1000mL煮沸半小時左右，至馬鈴薯酥而不爛為止，用四層紗布過濾，然後將事先稱好的瓊脂加到上述濾液中，用小火加熱，使之慢慢融化，並用玻棒不斷攪拌，以免燒焦鍋底。再加入事先用溫水溶化的糖溶液，用二層紗布過濾。測定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl調至pH為5.5～6.5之間，最後加水補足至1000mL[2]。
無菌室、接種箱的清潔：同2.1.1
無菌水的製備：取5-6mL蒸餾水裝入10mL小試管中，塞上棉塞，用報紙包裝好，115℃高壓滅菌20分鍾。
3.2.2 實驗的操作
取直徑7cm左右的圓形濾紙一張，鋪放於一個直徑9cm的平皿底部，上放一個U形玻棒，其上再平放一張幹淨的載玻片與一張蓋玻片，蓋好平皿蓋，進行滅菌[3]。
為防止培養過程中培養基幹燥，特在濾紙上滴加無菌水3-4mL，挑取真菌孢子接入盛有滅菌水的試管中，震蕩試管製成孢子懸液。用滅菌滴管吸取滅菌後熔化的固體培養基少許，滴於上述滅菌平皿內的載玻片中央，並用接種環將孢子懸液接種在培養基上，然後蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕壓一下，最後蓋上平皿蓋,
即成為載片小培養[4]。
3.3 真菌的保存
3.3.1 保存瓊脂培養基的製備
取蛋白腖10克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升至燒杯中混勻，在電爐上加熱融化，調整PH值至5.4，分裝試管，115℃滅菌20分鍾，擺成斜麵[5]。
無菌室及接種箱的清潔：同2.1.1
3.3.2 實驗操作
將劃線分離培養28℃2-3天的平板從溫箱取出，放入無菌室中進行以下的操作：在無菌室中靠近酒精火焰處，從平板培養基上選取可疑菌落，用接種環輕輕刮取其表麵的少許孢子，拉出接種環立即伸入斜麵培養基上，勿碰及斜麵和管壁，直達斜麵底部從斜麵底部開始劃曲線，向上至斜麵頂端為止，管口通過火焰滅菌，將棉塞塞好。接種完畢，接種環通過火焰滅菌後放下接種棒，最後在斜麵管壁上注明日期，置28℃溫箱中培養2-3天，後置4℃冰箱中保存[6]。
3.4 酵母菌的鑒定——生化試驗
3.4.1 糖發酵試驗
用12.5%豆芽汁配製成2%糖溶液（棉子糖為4%）分裝杜氏管。測定發酵的容器以杜氏管為主，凡能發酵某種糖則在杜氏管內小管之頂部應能看到有一定量的CO2氣泡[7]。具體操作：A.將豆芽汁分裝杜氏小管，每管1.2ml，15磅滅菌15分鍾。B.把各種糖用滅菌蒸餾水分別配成10%的糖溶液，煮沸15分鍾，稍冷，用無菌吸管吸取一定糖液，分裝於杜氏管，使糖濃度達到2%（棉子糖4%），即成為糖類發酵基礎培養基。C.欲鑒定的新培養菌株，接種於發酵管，25-28℃培養，每天觀察結果。一般觀察2-3天即可，凡不發酵者或弱發酵者，可延長觀察至10天，因半乳糖酶是適應酶，故觀察發酵半乳糖可延長2周至1個月[8]。
3.4.2 同化碳源試驗
A.菌液製備：將酵母菌製成菌懸液（1ml無菌生理鹽水接入少許約一接種環的新培養的酵母菌製成懸液）。B.澆製平板：將此懸液全部倒入經溶化並冷卻至45℃左右的20ml基礎培養基中，倒入培養皿，使菌體在培養基中混和均勻，靜止，凝固後在28℃把培養皿倒置幾小時，使表麵不致太濕。C.點樣：然後在培養皿底部做上碳源名稱的標記，分別用無菌不鏽鋼匙或無菌藥匙，按標記加糖少許（約米粒大），如果結果不明顯可於第二天再補加一次糖。D.觀察：觀察結果時以葡萄糖作對照，一般是25-28℃培養1-2天觀察結果，凡能同化者在所加碳源的周圍形成生長圈。凡生長緩慢的酵母或是在測半乳糖同化時，可適當采用液體培養法，即在含某種碳源的液體培養集中接入酵母，25-28℃培養1-2周，以含葡萄糖的液體培養基作對照，觀察酵母生長情況，是否更加渾濁或形成環、島等，必要時可延長觀察查到三周[9]。
4 結果與分析
4.1 真菌的培養性狀觀察
4.1.1 真菌在固體培養基上的生長表現
酵母菌在固體培養基上的生長表現：酵母菌在固體培養基上菌落呈油脂狀或臘脂狀，表麵光滑、濕潤、粘稠，有的表麵呈粉粒狀，粗糙或皺褶，菌落邊緣整齊、缺損或帶絲狀。菌落顏色有乳白色、黃色和紅色等。
黴菌在固體培養基上的生長表現：將不同黴菌在固體培養基上培養2-3天，可見黴菌菌落有絨毛狀、絮狀、繩索狀等。菌落大小依種而異，有的能擴展到整個固體培養基，有的有一定局限性（直徑1-2㎝或更小），很多黴菌的孢子和菌絲能產生色素，致使菌落表麵、背麵甚至培養基呈現不同顏色，如黃色、綠色、黑色、橙色等。
4.1.2 真菌的載片培養的形態觀察
酵母菌的載片小培養的形態觀察：類似於細胞，多數為單細胞，一般為橢圓形、圓形或圓柱形。酵母細胞比細胞大，有些酵母與其子細胞連接形成鏈狀，形成假菌絲。酵母菌以無絲分裂為主，主要為裂殖、芽殖。
黴菌在小培養上的生長鏡檢表現：菌體由許多分枝或不分枝的菌絲構成，許多菌絲交織在一起組成菌絲體。菌絲在顯微鏡下呈管狀，多數為有隔菌絲，菌絲被分隔成多個細胞，每個細胞含一個或多個細胞核，孢子為分生孢子。
4.2 圖片分析
4.2.1
圖1 產黃青黴的菌落 圖2 產黃青黴的菌絲和孢子
28℃生長速較快，1-2天長出菌落，10-12天直徑為3-5㎝。初為白色，後變為藍或灰綠色。菌落的質地呈致密絨狀，菌落表麵有明顯的放射狀溝紋，邊緣為白色，菌落是成簇的菌絲體，無特殊氣味，反麵亮黃至暗黃色（結果見圖1）。
顯微鏡下低倍觀察：菌絲為有隔菌絲，菌絲被分隔成多個細胞，產生相當明確的分散的帚狀枝分生孢子鏈，分生孢子為橢圓形（結果見圖2）。
結合以上菌落形態及小培養的培養性狀觀察，可鑒定為產黃青黴。
4.2.2
圖3 新月彎孢黴的菌落 圖4 新月彎孢黴的菌絲和孢子
28℃不如青黴類生長速度快，3天長出菌落，顏色為暗灰綠色，背麵為藍黑色。菌落質地為棉絮狀，菌落為成簇的菌絲體，無特殊氣味（結果見圖3）。
顯微鏡下低倍觀察，菌絲分隔，多分枝，分生孢子梗直立。孢子在分生孢子梗上呈輪狀著生，具3個分隔彎曲（結果見圖4）。
結合以上菌落形態及小培養的培養性狀觀察，可鑒定為彎孢黴屬的新月彎孢黴。
4.2.3
圖5 酵母菌的菌落 圖6 酵母菌的細胞
28℃培養3天，菌落呈乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，表麵濕潤，粘稠。菌落外觀與細菌菌落相似，比細菌菌落大、厚、圓，不透明，有酒精味，易被接種針挑起（結果見圖5）。
顯微鏡下低倍觀察，生殖方式為芽殖，單細胞，呈圓形、卵圓形或臘腸形（結果見圖6）。
結合以上菌落形態及小培養的培養性狀觀察，可初步鑒定為酵母菌。
4.3 酵母菌的生理生化測定
測定結果如下表所示：
葡萄糖 麥芽糖 半乳糖 乳糖 蔗糖 蜜二糖 D-木糖 D-阿拉伯糖 L-阿拉伯糖
發酵 ＋ ＋ ＋ — ＋ —
同化 ＋ ＋ ＋ — ＋ — — — —
對於初步鑒定為啤酒酵母菌的菌落，進一步采用發酵和同化試驗進行確定。由以上一係列的生理生化指標，可鑒定為啤酒酵母菌。
5 討論
根據本論文所做實驗結合本人所查閱資料，現將真菌的基本培養條件及特征，黴菌、酵母菌的繁殖方式，真菌實驗研究的意義等討論如下：
本研究以沙保為分離培養基，明確了真菌的最佳培養條件，如培養基配方為葡萄糖20g/l,瓊脂10g/l;而土豆培養基在小培養時更利於孢子的形成,所以得到了比較多的菌絲和孢子量;為防止菌落連成片，小培養也應在觀察到孢子後及時拍照並放入冰箱待用;在沙氏培養基中培養的時間為2-3d,在沙保培養基中培養的時間為2-3d
,在小培養中培養的時間為1-2d
,培養溫度為28+1℃,該研究成本低,操作簡便,高效率,對於真菌的分離鑒定和菌種庫的建立具有一定的指導意義.今後需要進一步研究不同的真菌在培養基的特征性表現,以便於真菌的快速鑒定。
真菌的培養條件：真菌對營養要求不高，比較容易培養，喜酸性，最適PH為5-10；多數為嗜溫菌，最適溫度為22-28℃，少數致病真菌在37℃生長良好，個別真菌在0℃生長；需在高濕條件下才能生長，多數在相對濕度95%-100%條件下生長良好；真菌生長速度比細菌慢，培養數日後才形成典型菌落。
真菌菌落特征：1）黴菌菌落：由菌絲體和孢子組成，菌落比細菌和放線菌大，有的甚至布滿整個培養基表麵，菌落較疏鬆成絨毛或絮狀，因黴菌的基內菌絲在培養基內生長，故其菌落不易被接種針挑起；因黴菌孢子帶有各種顏色，使其菌落表麵也呈現黃、綠、青、橙、黑等顏色。2）酵母菌型菌落：由單細胞的酵母菌組成。其外觀與細菌相似。呈圓形，表麵濕潤光滑不透明，易被接種環挑起；多數菌落呈乳白色，少數為紅色；長時間培養的菌落表麵呈皺縮狀。3）類酵母型菌落：外觀與酵母菌落相似，但此菌落可向下生長，這是因為芽生孢子與母細胞連接形成的假菌絲伸入培養基內造成的，如白色念珠菌的菌落。
酵母菌以芽殖、裂殖、擲孢子方式進行繁殖。黴菌以無性繁殖（芽孢子、節孢子、厚垣孢子、孢子囊孢子、分生孢子）和有性繁殖（卵孢子、接合孢子、子囊孢子）進行繁殖。
另外，研究真菌有重要的意義，真菌這類微生物與人類的生產和生活有著密切的關係：1）真菌的工業利用：幾乎遍及人類生活的各種工業部門，如食品、紡織、製革、造紙、醫藥、洗滌、飼料以及石油發酵和三廢利用等，但真菌也引起相應部門的產品如食品、紡織品、皮革製品、電工器材等的腐蝕黴變。2）真菌與農業生產：真菌侵入植物體引起的植物病害，往往使農作物遭受重大損失甚至顆粒無收，如小麥鏽病等。真菌對植物也有其有益的作用，有些真菌與植物的根結合在一起形成菌根，結成共生和互利的複合體；同時真菌在其生長發育過程中還能分泌生長素促進植物的生長。3）真菌與醫療衛生：真菌藥材曆史悠久應用普遍，許多是名貴藥材。如靈芝、蟲草、茯苓、紅曲、竹黃、神曲、猴頭、木耳等約百多種，真菌對醫藥界做出了重要貢獻。但也有少數真菌可引起人類疾病，這些病原性真菌引起淺部真菌病和深部真菌病，因此我們要加強真菌病的診斷防治。4）真菌與生物工程：近年來真菌的分子生物學研究十分活躍，如以酵母菌為主的基因工程主要用於人胰島素和幹擾素等藥物的生產上，真菌在醫藥工業中取得的成就顯示了生物工程的巨大潛力。
該論文所涉及的實驗總的來說較為成功，取得了較為理想的結果，但局於本人對真菌研究經驗的有限以及實驗條件的不足，對真菌僅局限於基礎研究，未能做到特別的深入。
6 結論
真菌對人類有利有弊，真菌正越來越受到人們的重視，研究真菌有重要意義，本論文正是基於這一點，針對個別菌種展開了一些基礎性的研究。
本論文從了解和掌握真菌的基礎知識入手，來進行個別真菌的培養和鑒定，通過實驗了解了產黃青黴、新月彎胞黴和啤酒酵母的培養和鑒定程序，以及相應的培養特征和鑒定結果分析方法，為以後進一步開展真菌學的研究做好基礎性工作。
真菌的領域未被揭露和利用的還很多，所以對它們要繼續調查、研究和總結，以診斷農作物病害和人動物疾病，發展食品工業、醫藥工業、農業生產、醫療衛生、生物工程防治等，挖掘我國真菌資源，開發和利用有益的真菌，造福人類。
參考文獻
[1] 白毓謙等.微生物實驗技術，山東大學出版社，1987：459
[2] 廖萬清，吳紹熙，王高鬆等.真菌病學，人民衛生出版社，1989：93
[3] 張卓然等.醫學微生物學，科學出版社，1998：102-103
[4] 中國科學院微生物研究所等.常用與常見真菌，科學出版社，1973：251
[5] 李榆梅等.微生物學，中國醫藥科技出版社，1999：45
[6] 聞玉梅等.現代醫學微生物學，上海醫科大學出版社，1999：724
[7] Disalvo AF et al:infection caused Penicillium marneffei,Am
J Clin Path 1973：
6（10）:259
[8] Hall WJ:Penicillium endocarditis following open heart
surgery and prosthetie
valve insertion,Am Heart 1974：8（7）:501
[9] Huang SN et al:Acute disseminated penicilliosis Am J Clin
Path 1963：3（9）:167
致謝詞
首先感謝四年來學校、老師、同學對我的關心和幫助。本論文的完成，有賴於多方麵的幫助，感謝學校為我提供實驗場所和實驗材料，在此特別要感謝我的兩位實習老師，感謝任慧英老師為我提供研究方向和實驗設計指導，在論文的最後完成階段更要感謝她將我所完成的實驗結果拍成圖片插入論文；感謝鄒玲老師在實驗中給予的幫助。另外，還要感謝與我一起實習、始終同我一起應對難題克服困難的同學。最後，再次向在我實習期間給予我關心和
關鍵詞：真菌；菌落；菌絲；孢子
1 前言
真菌一詞來源於拉丁文的“蘑菇”，現在真菌這一名詞的概念不僅包括蘑菇，而是代表著一個相當龐大的生物類群。什麽是真菌呢？從生物學的觀點來看，它們是一大類真核微生物，無根莖葉，不含葉綠素，不能利用無機物來製造食物，靠寄生或腐生生活，僅少數為單細胞，其餘為多細胞，大多數真菌有分枝或不分枝的絲狀體，能進行有性生殖和無性生殖。從形態上分為酵母菌、黴菌、擔子菌。
其實，真菌並不像其看起來的這般抽象，在我們的日常生活中幾乎到處都有它們的存在，我們每個人都有過接觸和不同程度的感性認識。例如釀酒、製饅頭用的酵母；酒曲的曲種（曲黴和根黴）；做豆腐乳的毛黴和紅曲黴；發酵飼料的黑曲黴；味美可口的蘑菇、木耳、銀耳、猴頭；作為中藥的神曲、麥角、蟲草、茯苓、靈芝；此外還有食品、衣物、用具等因潮濕而發生的黴；引起農作物病害的小麥鏽病等等都是真菌。
真菌與細菌的大小、形態、結構及化學組成差異很大，單細胞個體比細菌大幾倍至幾十倍，具有細胞壁，但不含細菌細胞壁的肽聚糖。有些真菌因環境條件的改變而改變形態，稱之為真菌的兩相性，如假皮疽組織胞漿菌在動物機體呈酵母菌樣。而在人工培養基上呈絲狀。
真菌不僅種類多，數量大，而且分布極為廣泛，與人類生產與生活有著極密切的利害關係。有些菌絲可引起人與畜禽疾病，有些黴菌還產生毒素，直接或間接的危害人類健康。因此，了解真菌的培養方法，認識其形態十分重要。
近年來在真菌分類方麵趨向於采用Anisworth&bisby的《真菌學辭典》介紹的分類係統。該係統認為真菌不屬於低等植物，而是屬於單獨成立的真菌界，界以下分為黏菌門和真菌門。真菌門再分為鞭毛菌亞門、接合菌亞門、擔子菌亞門和半知菌亞門。本研究從自然界分離到幾株真菌，並用真菌分類方法對其進行了鑒定。
2 材料
2.1 病料
發了黴的紅薯、酸敗腐爛的蘋果
2.2 培養基
2.2.1 沙堡瓊脂培養基
成分：蛋白腖10克、麥芽糖40克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升
2.2.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基
成分：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升
2.2.3 保存瓊脂培養基
成分：蛋白腖10克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升
2.3 器材
無菌室、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電爐、天平、鐵架台、滅菌培養皿、錐形瓶、漏鬥、試管、燒杯、膠頭滴管、石蕊試紙、接種環、酒精燈、量筒、玻璃棒、紗布、濾紙、試管塞、報紙、紮繩、標簽、溫箱、冰箱、蓋玻片、載玻片、顯微鏡、杜氏管
3 方法
3.1 真菌的分離培養
3.1.1 實驗的準備
沙堡瓊脂培養基的製備：用天平稱取蛋白腖10克、麥芽糖40克、瓊脂20克，用量筒量取蒸餾水1000毫升置燒杯中混勻，在電爐上加熱熔化，加熱過程中不斷用玻璃棒攪拌，調整PH值至5.4，倒入錐形瓶中，115℃滅菌20分鍾，傾注平板，冷卻[1]。
無菌室、接種箱的清潔：用酒精棉球將接種箱的內部全部擦洗幹淨，放入試管架、酒精燈、標簽、接種環、筆、火柴等實驗用具放入接種箱內，密封接種箱。依次打開接種箱與無菌室的紫外燈，紫外線滅菌20分鍾。
3.1.2 劃線分離培養
在酒精燈火焰下進行以下操作：
（1）從發黴的紅薯上和酸敗腐爛的蘋果上挑取黴變物用28℃培養2-3天，分離出幾個真菌菌株。將分離株重新進行平板劃線分離，挑取單菌落表麵的少許孢子用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行載片小培養，經28℃培養2—3天於低倍鏡下觀察，通過菌絲和孢子對分離株進行鑒定。
（2）
左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開20度左右的角度（角度越小越好，以免空氣中的細菌進入皿中將培養基汙染）。劃線前先將接種環稍稍彎曲，這樣易和平皿內瓊脂麵平行，不致劃破培養基。
（3）
右手持接種環，將上述黴變物分區劃線接種於沙堡瓊脂培養基平板中，劃完前一個區域後將接種環在火焰上灼燒滅菌，冷卻後與前一區域的最後一兩條折線接觸劃出第二區域，依次類推，共劃三到四個區域。劃線中不宜過多的重複舊線，以免形成菌苔。
（4） 接種完畢，在皿底上作好日期，平皿倒扣，置28℃培養2-3天。
（5） 將分離培養得到的幾個分離株用沙堡瓊脂培養基重新進行平板劃線分離，以得到純的單一的菌落。
3.2 真菌的載片培養（小培養）
3.2.1 實驗的準備
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的製備：將新鮮的馬鈴薯洗淨、去皮，（注意：發黴、變綠的不要使用。）切成薄片或蠶豆大小的方塊，稱取所需的重量，倒入鍋內，加水1000mL煮沸半小時左右，至馬鈴薯酥而不爛為止，用四層紗布過濾，然後將事先稱好的瓊脂加到上述濾液中，用小火加熱，使之慢慢融化，並用玻棒不斷攪拌，以免燒焦鍋底。再加入事先用溫水溶化的糖溶液，用二層紗布過濾。測定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl調至pH為5.5～6.5之間，最後加水補足至1000mL[2]。
無菌室、接種箱的清潔：同2.1.1
無菌水的製備：取5-6mL蒸餾水裝入10mL小試管中，塞上棉塞，用報紙包裝好，115℃高壓滅菌20分鍾。
3.2.2 實驗的操作
取直徑7cm左右的圓形濾紙一張，鋪放於一個直徑9cm的平皿底部，上放一個U形玻棒，其上再平放一張幹淨的載玻片與一張蓋玻片，蓋好平皿蓋，進行滅菌[3]。
為防止培養過程中培養基幹燥，特在濾紙上滴加無菌水3-4mL，挑取真菌孢子接入盛有滅菌水的試管中，震蕩試管製成孢子懸液。用滅菌滴管吸取滅菌後熔化的固體培養基少許，滴於上述滅菌平皿內的載玻片中央，並用接種環將孢子懸液接種在培養基上，然後蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕壓一下，最後蓋上平皿蓋,
即成為載片小培養[4]。
3.3 真菌的保存
3.3.1 保存瓊脂培養基的製備
取蛋白腖10克、瓊脂20克、蒸餾水1000毫升至燒杯中混勻，在電爐上加熱融化，調整PH值至5.4，分裝試管，115℃滅菌20分鍾，擺成斜麵[5]。
無菌室及接種箱的清潔：同2.1.1
3.3.2 實驗操作
將劃線分離培養28℃2-3天的平板從溫箱取出，放入無菌室中進行以下的操作：在無菌室中靠近酒精火焰處，從平板培養基上選取可疑菌落，用接種環輕輕刮取其表麵的少許孢子，拉出接種環立即伸入斜麵培養基上，勿碰及斜麵和管壁，直達斜麵底部從斜麵底部開始劃曲線，向上至斜麵頂端為止，管口通過火焰滅菌，將棉塞塞好。接種完畢，接種環通過火焰滅菌後放下接種棒，最後在斜麵管壁上注明日期，置28℃溫箱中培養2-3天，後置4℃冰箱中保存[6]。
3.4 酵母菌的鑒定——生化試驗
3.4.1 糖發酵試驗
用12.5%豆芽汁配製成2%糖溶液（棉子糖為4%）分裝杜氏管。測定發酵的容器以杜氏管為主，凡能發酵某種糖則在杜氏管內小管之頂部應能看到有一定量的CO2氣泡[7]。具體操作：A.將豆芽汁分裝杜氏小管，每管1.2ml，15磅滅菌15分鍾。B.把各種糖用滅菌蒸餾水分別配成10%的糖溶液，煮沸15分鍾，稍冷，用無菌吸管吸取一定糖液，分裝於杜氏管，使糖濃度達到2%（棉子糖4%），即成為糖類發酵基礎培養基。C.欲鑒定的新培養菌株，接種於發酵管，25-28℃培養，每天觀察結果。一般觀察2-3天即可，凡不發酵者或弱發酵者，可延長觀察至10天，因半乳糖酶是適應酶，故觀察發酵半乳糖可延長2周至1個月[8]。
3.4.2 同化碳源試驗
A.菌液製備：將酵母菌製成菌懸液（1ml無菌生理鹽水接入少許約一接種環的新培養的酵母菌製成懸液）。B.澆製平板：將此懸液全部倒入經溶化並冷卻至45℃左右的20ml基礎培養基中，倒入培養皿，使菌體在培養基中混和均勻，靜止，凝固後在28℃把培養皿倒置幾小時，使表麵不致太濕。C.點樣：然後在培養皿底部做上碳源名稱的標記，分別用無菌不鏽鋼匙或無菌藥匙，按標記加糖少許（約米粒大），如果結果不明顯可於第二天再補加一次糖。D.觀察：觀察結果時以葡萄糖作對照，一般是25-28℃培養1-2天觀察結果，凡能同化者在所加碳源的周圍形成生長圈。凡生長緩慢的酵母或是在測半乳糖同化時，可適當采用液體培養法，即在含某種碳源的液體培養集中接入酵母，25-28℃培養1-2周，以含葡萄糖的液體培養基作對照，觀察酵母生長情況，是否更加渾濁或形成環、島等，必要時可延長觀察查到三周[9]。
4 結果與分析
4.1 真菌的培養性狀觀察
4.1.1 真菌在固體培養基上的生長表現
酵母菌在固體培養基上的生長表現：酵母菌在固體培養基上菌落呈油脂狀或臘脂狀，表麵光滑、濕潤、粘稠，有的表麵呈粉粒狀，粗糙或皺褶，菌落邊緣整齊、缺損或帶絲狀。菌落顏色有乳白色、黃色和紅色等。
黴菌在固體培養基上的生長表現：將不同黴菌在固體培養基上培養2-3天，可見黴菌菌落有絨毛狀、絮狀、繩索狀等。菌落大小依種而異，有的能擴展到整個固體培養基，有的有一定局限性（直徑1-2㎝或更小），很多黴菌的孢子和菌絲能產生色素，致使菌落表麵、背麵甚至培養基呈現不同顏色，如黃色、綠色、黑色、橙色等。
4.1.2 真菌的載片培養的形態觀察
酵母菌的載片小培養的形態觀察：類似於細胞，多數為單細胞，一般為橢圓形、圓形或圓柱形。酵母細胞比細胞大，有些酵母與其子細胞連接形成鏈狀，形成假菌絲。酵母菌以無絲分裂為主，主要為裂殖、芽殖。
黴菌在小培養上的生長鏡檢表現：菌體由許多分枝或不分枝的菌絲構成，許多菌絲交織在一起組成菌絲體。菌絲在顯微鏡下呈管狀，多數為有隔菌絲，菌絲被分隔成多個細胞，每個細胞含一個或多個細胞核，孢子為分生孢子。
4.2 圖片分析
4.2.1
圖1 產黃青黴的菌落 圖2 產黃青黴的菌絲和孢子
28℃生長速較快，1-2天長出菌落，10-12天直徑為3-5㎝。初為白色，後變為藍或灰綠色。菌落的質地呈致密絨狀，菌落表麵有明顯的放射狀溝紋，邊緣為白色，菌落是成簇的菌絲體，無特殊氣味，反麵亮黃至暗黃色（結果見圖1）。
顯微鏡下低倍觀察：菌絲為有隔菌絲，菌絲被分隔成多個細胞，產生相當明確的分散的帚狀枝分生孢子鏈，分生孢子為橢圓形（結果見圖2）。
結合以上菌落形態及小培養的培養性狀觀察，可鑒定為產黃青黴。
4.2.2
圖3 新月彎孢黴的菌落 圖4 新月彎孢黴的菌絲和孢子
28℃不如青黴類生長速度快，3天長出菌落，顏色為暗灰綠色，背麵為藍黑色。菌落質地為棉絮狀，菌落為成簇的菌絲體，無特殊氣味（結果見圖3）。
顯微鏡下低倍觀察，菌絲分隔，多分枝，分生孢子梗直立。孢子在分生孢子梗上呈輪狀著生，具3個分隔彎曲（結果見圖4）。
結合以上菌落形態及小培養的培養性狀觀察，可鑒定為彎孢黴屬的新月彎孢黴。
4.2.3
圖5 酵母菌的菌落 圖6 酵母菌的細胞
28℃培養3天，菌落呈乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，表麵濕潤，粘稠。菌落外觀與細菌菌落相似，比細菌菌落大、厚、圓，不透明，有酒精味，易被接種針挑起（結果見圖5）。
顯微鏡下低倍觀察，生殖方式為芽殖，單細胞，呈圓形、卵圓形或臘腸形（結果見圖6）。
結合以上菌落形態及小培養的培養性狀觀察，可初步鑒定為酵母菌。
4.3 酵母菌的生理生化測定
測定結果如下表所示：
葡萄糖 麥芽糖 半乳糖 乳糖 蔗糖 蜜二糖 D-木糖 D-阿拉伯糖 L-阿拉伯糖
發酵 ＋ ＋ ＋ — ＋ —
同化 ＋ ＋ ＋ — ＋ — — — —
對於初步鑒定為啤酒酵母菌的菌落，進一步采用發酵和同化試驗進行確定。由以上一係列的生理生化指標，可鑒定為啤酒酵母菌。
5 討論
根據本論文所做實驗結合本人所查閱資料，現將真菌的基本培養條件及特征，黴菌、酵母菌的繁殖方式，真菌實驗研究的意義等討論如下：
本研究以沙保為分離培養基，明確了真菌的最佳培養條件，如培養基配方為葡萄糖20g/l,瓊脂10g/l;而土豆培養基在小培養時更利於孢子的形成,所以得到了比較多的菌絲和孢子量;為防止菌落連成片，小培養也應在觀察到孢子後及時拍照並放入冰箱待用;在沙氏培養基中培養的時間為2-3d,在沙保培養基中培養的時間為2-3d
,在小培養中培養的時間為1-2d
,培養溫度為28+1℃,該研究成本低,操作簡便,高效率,對於真菌的分離鑒定和菌種庫的建立具有一定的指導意義.今後需要進一步研究不同的真菌在培養基的特征性表現,以便於真菌的快速鑒定。
真菌的培養條件：真菌對營養要求不高，比較容易培養，喜酸性，最適PH為5-10；多數為嗜溫菌，最適溫度為22-28℃，少數致病真菌在37℃生長良好，個別真菌在0℃生長；需在高濕條件下才能生長，多數在相對濕度95%-100%條件下生長良好；真菌生長速度比細菌慢，培養數日後才形成典型菌落。
真菌菌落特征：1）黴菌菌落：由菌絲體和孢子組成，菌落比細菌和放線菌大，有的甚至布滿整個培養基表麵，菌落較疏鬆成絨毛或絮狀，因黴菌的基內菌絲在培養基內生長，故其菌落不易被接種針挑起；因黴菌孢子帶有各種顏色，使其菌落表麵也呈現黃、綠、青、橙、黑等顏色。2）酵母菌型菌落：由單細胞的酵母菌組成。其外觀與細菌相似。呈圓形，表麵濕潤光滑不透明，易被接種環挑起；多數菌落呈乳白色，少數為紅色；長時間培養的菌落表麵呈皺縮狀。3）類酵母型菌落：外觀與酵母菌落相似，但此菌落可向下生長，這是因為芽生孢子與母細胞連接形成的假菌絲伸入培養基內造成的，如白色念珠菌的菌落。
酵母菌以芽殖、裂殖、擲孢子方式進行繁殖。黴菌以無性繁殖（芽孢子、節孢子、厚垣孢子、孢子囊孢子、分生孢子）和有性繁殖（卵孢子、接合孢子、子囊孢子）進行繁殖。
另外，研究真菌有重要的意義，真菌這類微生物與人類的生產和生活有著密切的關係：1）真菌的工業利用：幾乎遍及人類生活的各種工業部門，如食品、紡織、製革、造紙、醫藥、洗滌、飼料以及石油發酵和三廢利用等，但真菌也引起相應部門的產品如食品、紡織品、皮革製品、電工器材等的腐蝕黴變。2）真菌與農業生產：真菌侵入植物體引起的植物病害，往往使農作物遭受重大損失甚至顆粒無收，如小麥鏽病等。真菌對植物也有其有益的作用，有些真菌與植物的根結合在一起形成菌根，結成共生和互利的複合體；同時真菌在其生長發育過程中還能分泌生長素促進植物的生長。3）真菌與醫療衛生：真菌藥材曆史悠久應用普遍，許多是名貴藥材。如靈芝、蟲草、茯苓、紅曲、竹黃、神曲、猴頭、木耳等約百多種，真菌對醫藥界做出了重要貢獻。但也有少數真菌可引起人類疾病，這些病原性真菌引起淺部真菌病和深部真菌病，因此我們要加強真菌病的診斷防治。4）真菌與生物工程：近年來真菌的分子生物學研究十分活躍，如以酵母菌為主的基因工程主要用於人胰島素和幹擾素等藥物的生產上，真菌在醫藥工業中取得的成就顯示了生物工程的巨大潛力。
該論文所涉及的實驗總的來說較為成功，取得了較為理想的結果，但局於本人對真菌研究經驗的有限以及實驗條件的不足，對真菌僅局限於基礎研究，未能做到特別的深入。
6 結論
真菌對人類有利有弊，真菌正越來越受到人們的重視，研究真菌有重要意義，本論文正是基於這一點，針對個別菌種展開了一些基礎性的研究。
本論文從了解和掌握真菌的基礎知識入手，來進行個別真菌的培養和鑒定，通過實驗了解了產黃青黴、新月彎胞黴和啤酒酵母的培養和鑒定程序，以及相應的培養特征和鑒定結果分析方法，為以後進一步開展真菌學的研究做好基礎性工作。
真菌的領域未被揭露和利用的還很多，所以對它們要繼續調查、研究和總結，以診斷農作物病害和人動物疾病，發展食品工業、醫藥工業、農業生產、醫療衛生、生物工程防治等，挖掘我國真菌資源，開發和利用有益的真菌，造福人類。
參考文獻
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valve insertion,Am Heart 1974：8（7）:501
[9] Huang SN et al:Acute disseminated penicilliosis Am J Clin
Path 1963：3（9）:167
致謝詞
首先感謝四年來學校、老師、同學對我的關心和幫助。本論文的完成，有賴於多方麵的幫助，感謝學校為我提供實驗場所和實驗材料，在此特別要感謝我的兩位實習老師，感謝任慧英老師為我提供研究方向和實驗設計指導，在論文的最後完成階段更要感謝她將我所完成的實驗結果拍成圖片插入論文；感謝鄒玲老師在實驗中給予的幫助。另外，還要感謝與我一起實習、始終同我一起應對難題克服困難的同學。最後，再次向在我實習期間給予我關心和
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