昆山腔形成以後，雖然躋身於四大聲腔之列，但直到嘉靖初年，影響還很小，基本上隻在蘇州府和鬆江府一帶流傳。嘉靖初年“有魏良輔者，流寓婁東、鹿城之間”（見沈寵綏《度曲須知 曲運隆衰》）。這裏鹿城是今江蘇昆山，不是浙江溫州，周時地稱婁邑屬吳國，因吳王曾在這裏豢鹿狩獵，故又名鹿城，秦設婁縣。因吳王曾在這裏豢鹿狩獵，故又名鹿城。當時蘇、鬆兩府是全國經濟最發達，生活最富庶的地區，當地的戲曲發展已十分繁盛，不僅戲班多，而且官府裏經常有戲班呈應，民間的戲曲活動也不少，尤其是唱清曲，最有代表性的則是蘇州虎丘的“中秋曲會”，自從十六世紀初期開始一直延續到十八世紀的清代中期，可見當時戲曲有多盛行。史料中最早提到魏良輔的是明代文學家、戲曲作家李開先（1502～1568）的《詞謔》中說“昆山陶九官，太倉魏上泉，而周夢穀、滕全拙、朱南川……皆長於歌而劣於彈，魏良輔兼能醫……”上泉又作尚泉是魏良輔的字，長期寄居太倉，以演唱民間曲調為職業。這種職業使魏良輔接觸到北方和南方的多種曲調，通過比較研究，他對昆山腔曲調平直簡單、缺少起伏變化這一狀況日漸感到不滿，於是和一批藝術上的誌同道合者親密合作，開始了對昆山腔的全麵改革。
清初文學家餘懷(1617～1696)，字澹心，福建莆田人，在《寄暢園聞歌記》中說：“良輔初習北音，絀於北人王友山，退而縷心南曲，足跡不下樓十年。當是時，南曲率平直無意致，良輔轉喉神調，度為新聲。”魏良輔熟悉音律，開始是唱北曲，因為比不上北方人王友山，於是轉而鑽研南曲。他居住在太倉南碼頭，當地駐軍中，有很多人通曉音律，魏良輔常與他們切磋技藝和商討樂理。這時，他結識了駐地的一位南曲專家、太倉衛百戶過雲適，常向他請教，每次度曲都要等到過雲適認為滿意了方肯罷休。他還請教從安徽壽州（今壽縣）發配至太倉的善弦索、北曲的戲劇家張野塘。明末人宋直方《瑣聞錄》有記載“野塘，河北人，以罪發蘇州大倉衛，素工弦索……昆山魏良輔者，善南曲，為吳中國工。一日至大倉聞野塘歌，心異之，留聽三日夜，大稱善，遂與野塘定交。時良輔（年）五十餘，有一女亦善歌，諸貴人爭求之，不許，至是竟以委野塘。”為了藝術的同好，不顧張野塘勞改犯的身份，把諸貴人爭求之的女兒嫁給他，也夠驚世駭俗的。
魏良輔在過雲適、張野塘等人的協助下，在原來昆山腔的基礎上，吸收了當時流行的海鹽腔、餘姚腔以及江南民歌小調的某些特點，對流傳於昆山一帶的戲曲唱腔進行加工整理，匯集南方和北方各種曲調的優長之處，同時借鑒江南民歌小調音樂，整合出一種不同以往的新式曲調，將南北曲融合為一體，既可使南曲“收音純細”，又可使北曲“轉無北氣”，從而改變了以往那種平直無意韻的呆板唱腔。演唱時注意使歌詞的音調與曲調相配合，同時延長字的音節，造成舒緩的節奏，給人以特殊的音樂美感，。形成了一種格調新穎、唱法細膩、以字行腔、舒徐委婉的“水磨腔”， 這就是流傳後世的昆腔。它以清唱的形式出現，終於使昆腔在無大鑼大鼓烘托的氣氛下能夠清麗悠遠，旋律更加優美。魏良輔善於演唱，但對樂器並不精通，而張野塘是個很有才華的民間音樂家，他充分發揮自己的專長，協助魏良輔將北方曲調吸收到南方的昆曲中來。同時對原來北方曲調的伴奏樂器三弦進行改造，將它與簫、笛、拍板、琵琶、鑼鼓等樂器共同用在昆曲的伴奏之中，獲得成功。
魏良輔十年“足不下樓”，用十年磨一劍的精神改革昆山腔的具體做法，一是“盡洗乖聲”即清除違背音律的“倒字腔”，以達到字正腔圓的藝術效果；二是“調用水磨”即把曲調設計得委婉細膩，像“水磨”的效果那樣軟綿滑潤；三是“拍挨冷板”即製訂抒緩的清唱板式，並交給鼓師指揮，使唱腔優美動人。此外，還將昆曲語言改為“中州官話”，因而去除了大範圍傳播的障礙。他還選定曲笛作為昆曲的主奏樂器，與“水磨腔”珠聯璧合。經魏良輔一係列的改良，使昆山腔脫離了裏巷歌謠、村坊小曲式的低迷階段，成為可登大雅之堂的正聲。在1550年前後，魏良輔被崇奉為昆山腔唱曲的領導者地位，他的年齡也達到了50來歲。這時候在他身邊還聚集了善洞簫的蘇州張梅穀，善笛子的昆山謝林泉，培養了優秀歌手張小泉、季敬坡、戴梅川、包郎郎等一批人，形成了一個誌同道合的藝術沙龍。
昆曲改革的成功給魏良輔帶來了巨大的聲譽，被譽為“國工”、“曲聖”，乃至昆腔（南曲）“鼻祖”。他的著作《南詞引正》一書，是論述昆腔唱法及南北曲流派的重要文獻。這種新式的曲調一經問世，立即以不可抗拒的藝術魅力征服了當時的廣大聽眾。一批民間音樂家紛紛向魏良輔學習昆曲的演唱技法，使得這一優美的曲調很快在周圍地區傳播開來。
清唱還不是戲劇，真正的戲劇，必須有台上的正式表演。戲曲需要有劇本，才可以在舞台上演出，最早用昆曲形式演出的劇作一般認為是昆山人梁辰魚（約1521―約1594）的《浣紗記》。據說梁辰魚曾得到魏良輔的真傳，在昆曲演唱上具有很高的造詣，在昆山當地極受尊重，周圍地區的歌童、歌女爭著上門請他指點演唱技巧，甚至還有人不遠千裏來向他學習。梁辰魚的傳奇《浣紗記》，取材於春秋時代吳越興亡的故事。首出《家門》雲：“看今古浣紗新記，舊名吳越春秋”，可見此劇係依據名為《吳越春秋》的舊本改編而成。《錄鬼簿》著錄的元雜劇有《進西施》（關漢卿作）和《越王嚐膽》（宮天挺作），劇本已佚。《浣紗記》的情節比史書上的記載和有關的曆史傳說更加豐富。如開頭寫範蠡與西施在苧蘿西村的溪水邊相遇並相愛，西施贈範蠡一縷溪紗作為定情之物。後越國為吳國所敗，範蠡以國事為重，勸說西施到吳國去。臨別時將溪紗分開，二人各持一半。末尾寫滅吳之後二人在太湖舟中成婚，又取出溪紗，一同泛海而去。這些情節有助於塑造範蠡和西施兩個富有自我犧牲精神的愛國者的形像。以二人的愛情故事和一縷溪紗貫串全劇始終，也使結構更加完整。梁辰魚同一些民間樂師合作，對魏良輔改革後的昆曲作了進一步加工，創作出《浣紗記》劇本的同時，作《江東白苧》 、《浣紗》諸曲，用昆曲形式在舞台上演出。
經過魏良輔的改革和梁辰魚的藝術實踐，昆曲的影響越來越大，很快傳播到江蘇、浙江的廣大地區，成為這些地域主要的戲劇形式。當時的文壇盟主王世貞，還為之寫下“吳閶白麵冶遊兒，爭唱梁郎雪豔詞”的詩句。文人學士，爭用昆腔新聲撰作傳奇，許多原有的傳奇作品也紛紛以昆曲形式被搬上舞台，特別是湯顯祖的臨川四夢。這裏有一段插曲。當年湯顯祖的劇本《牡丹亭》尚未寫完，便不脛而走，昆山的梨園弟子紛紛拿去“朝歌夜舞”。但是很快出現了能不能用昆山腔演唱的問題。依字行腔的昆曲，十分講究語言。為了保證字正腔圓，還引申出許多常用的裝飾腔格式。許多人以昆山腔的尺度衡量它，覺得《牡丹亭》的曲辭不合規律，腔、板絕不分辨，襯詞、襯句湊插乖舛，唱起來簡直會拗折人們的嗓子。作為江西臨川人氏，湯顯祖無疑更習慣於用宜黃腔、樂平腔、弋陽腔來創作。看來是由於語言方麵的局限，他的劇本很快出現了沈璟、馮夢龍、呂天成、臧懋循、碩園等人的改編本，其中有不少是以方便昆曲演唱為目的而改編的。但是這些改編本都不為湯顯祖所承認。湯顯祖在給宜黃伶人羅章二的信中明確指出：“《牡丹亭記》要依我原本，其呂家（指呂天成）改的切不可從，雖是增減一二字以便俗唱，卻與我原本的意趣大不同了。”其實改編者如沈璟，本身就是曲學大師，也會寫傳奇，不會偏離原作太遠。
到萬曆年間它的影響已從吳中擴展到江浙各地。昆曲傳奇如汪廷納的《獅吼記》（演繹蘇軾好友陳季常怕老婆的故事）、張鳳翼的《紅拂記》（演繹唐人傳奇虯髯客、紅拂女和李靖風塵三俠故事）、高濂的《玉簪記》（演繹潘必正、陳妙常愛情故事）等的紛紛問世，加速了昆曲作為一個劇種的形成。萬曆年間，家庭昆班開始大量湧現。在江南園林中，一個個昆曲舞台一步步被搭建起來。點點滴滴的戲曲元素加入進來。配器從簡單到齊備、表演從無到有、行當從少到多、舞台從簡陋到富麗堂皇。萬曆末，昆曲已是“四方歌曲必宗吳門”，並且“聲各小變，腔調略同”，形成了眾多流派，一躍而居諸腔之首。昆腔傳入北京，又迅速取代了繼北曲之後盛行於北京的弋陽腔（京腔）。它不僅為士大夫所喜愛，而且也深受群眾歡迎，遂逐漸發展成全國性劇種，稱為“官腔”，而各地方劇種則被叫做“亂彈”或“雜凋”。
萬曆時期，著名演員有蔣六、宇四等，著名的昆曲戲班有南京的沈周班，士大夫蓄養的家班有申時行（萬曆朝多年的首輔）、張岱（著名文學家）等。明末清初，士大夫蓄養家班成風，著名的有阮大铖家班、長洲尤桐家班等。著名戲班有北京的聚和、三也、可娛，南京的興化。蘇州的寒香、凝碧等。除了家班和職業戲班的舞台演出外，民間的清唱活動也十分流行。特別是在蘇州一帶，明末清初每年的中秋之夜在蘇州的虎丘曲會都有清唱聚會。.它的參加人數之多，演唱水平之高，參加者情緒之熱烈，可謂空前絕後。李漁寫的詩《虎丘千人石上聽曲》 ：“一讚一回好，一字一聲血，幾令善歌人，唱殺虎丘月。”反映了當時的盛況。清唱活動推動了當時整個社會性昆曲演唱的普及和進步，許多清曲家還結合自己的演唱，對昆曲的唱法進行精研和考訂，刊印眾多昆曲曲譜流傳於世。著名如蘇州曲家葉堂整理校訂的《納書楹曲譜》，他所記錄的葉派唱法，為後代清曲家和專業演員習唱昆曲的經典曲譜。直到晚清，清曲家結社習唱昆曲之風仍在江蘇、上海、浙江和北京等地流行。有些清曲家還不時登台演出，其中也有佼佼者下海成了著名的昆劇表演藝術家。昆曲藝術在它的發展過程中，大批既是實踐家又是理論家的湧現，也使它全部活動和進展始終伴隨著清晰的邏輯表述和理論性指導。
從魏良輔《南詞引正》、沈寵綏的《弦索辨訛》和《度曲須知》開始，文人們在從事昆曲活動時都賦予了一定的理論意識，努力把自己的實踐活動上升到理性高度。到了明萬曆年間，以湯顯祖和沈璟的出色理論成果和著名“意趣神色”與“詞人當行，歌客守腔，大家細把音律講”的理論對峙為標誌，加上潘之恒《鸞嘯小品》的表演理論以及胡應麟《少室山房筆叢》，徐複祚《三家村老委談》，臧懋循《元曲選序文》 ，呂天成《曲品》等論述，使理論水平的構築有了整體建樹。此後又有是中國戲曲史上第一部全麵的、係統的、獨創性的理論著作：王驥德《曲律》，以及祁彪佳《遠山堂劇品》 ，孟稱舜《古今名劇合選序》的思考，接連不斷。到了清代，中國古代最偉大的戲曲理論家李漁的《閑情偶寄》在昆曲領域應運而生，又出現了昆曲表演理論著作《梨園原》 ，以及其他種種理論著作，從而使昆曲的發展在中國戲劇史上獲得了無可匹敵的至高地位,，後世其他劇種眾生和發展的影響十分深遠，因此它也享有了“百戲之師”之盛譽。它所達到的文化品位在整個中國戲曲史上，至今也是絕無僅有。
