明尼蘇達大學的李方和石正麗的電子郵件被《美國知情權》披露，顯示石正麗已經完成對冠狀病毒的422突刺的序列已經成功進行了重組：
Re: 422 spike sequence
From: Fang Li
To: zlshi
Sent: February 10, 2018 4:59:31 PM CST
Received: February 10, 2018 4:59:31 PM CST
Thanks, Zhengli. I will let Ralph know.
Best,
Fang
On Fri, Feb 9, 2018 at 8:09 PM, zlshi wrote:
Dear Fang，
There should no problem if there is not too much overlapping with our work. I suppose that he want to
consctruct the recombinant virus with the 422 spike gene. We have already done this swapping on the
MERS-CoV backbone. The recombinant virus could be rescused upon transfection of genome plasmid,
but couldn't grow in the following passage. We have stop here for the moment. I would encourge him to
have a try.
Best regards,
Zhengli,
SHI Zhengli, Ph. D
Senior Scientist & Professor
Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences
44 Xiao Hong Shan
430071 Wuhan, Hubei
China
Tel & Fax: (0086) 27 87197240
Email: zlshi@wh.iov.cn
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From: Fang Li
Date: 2018-02-10 01:22
To: Zhengli Shi
Subject: 422 spike sequence
Dear Zhengli,
I just talked to Ralph Baric on the phone. I mentioned to him about your recent work on 422 that is
currently under review at JVI. He asked whether he could get the sequence of the 422 spike
protein. I said that I would need to check with you. Please let me know what you think.
Thanks,
Fang
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Fang Li, Ph.D.
Associate Professor
Department of Veterinary and Biomedical Sciences
University of Minnesota Twin Cities
612-625-6149, lifang@umn.edu
機翻如下：
回複：422 spike sequence
發件人：Fang Li <lifang@umn.edu>
收件人：zlshi <zlshi@wh.iov.cn>
發送日期：2018年2月10日 下午4：59：31 CST
收到時間：2018年2月10日 下午4：59：31 CST
感謝，正利。我會告訴拉爾夫。
祝你好，
方
2018年2月9日星期五晚上8：09，zlshi <zlshi@wh.iov.cn>寫道：
親愛的方，
隻要我們的工作沒有太多重疊，應該沒問題。我猜他想
構建帶有422刺突基因的重組病毒。我們已經在
MERS-CoV主幹網上做過這種交換。重組病毒可以在轉染基因組質粒時被回收，
但無法在後續通道中生長。我們暫時得停在這裏。我會鼓勵他
試試看。
此致，
鄭利，
施正利，博士
，中國科學院
武漢病毒研究所高級科學家兼教授，
44 湖北
市武漢，肖紅
430071山 電信傳真：（0086） 27 87197240
電子郵件：zlshi@wh.iov.cn
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發件人：方李
日期：2018-02-10 01：22
收件人：石
正裏 主題：422 尖刺序列
親愛的正利，
我剛和拉爾夫·巴裏克通了電話。我跟他提到了你最近關於422的研究，目前正在
JVI進行審查。他詢問是否能獲得422刺突
蛋白的序列。我說我需要先和你確認。請告訴我你的看法。
謝謝，
方
——
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方李博士
明尼蘇達
大學雙子城
分
校獸醫與生物醫學科學係副教授，電話612-625-6149，lifang@umn.edu
NIH文件揭示了COVID-19疫情前更廣泛的冠狀病毒工程研究
文件顯示，多個美國資助項目的科學家提出改變蝙蝠病毒中的刺突蛋白和切割位點——這些工作呼應了後來備受爭議的DEFUSE提案中提出的想法
早在武漢首次已知的新冠病例出現之前，一個鬆散的科學家網絡——由美國政府資助支持並通過多次合作聯係——已經在進行實驗，試圖回答一個看似簡單的問題：新發現的蝙蝠冠狀病毒感染人類需要什麽條件？
這個問題在資助申請、電子郵件和NIH內部評審中反複出現。研究人員提出改造病毒刺突蛋白——即附著在宿主細胞上的部分——以測試蝙蝠病毒是否能更緊密地結合人類受體。他們還探討了病毒切割位點的變化，這些分子開關使病毒能夠更高效地解鎖並進入細胞。
這些病毒改造很快卷入了疫情中最具爭議的問題：SARS-CoV-2是通過動物向人類的自然溢出，還是通過與預判下一次疫情研究相關的實驗室事件？這場辯論的導火點是DEFUSE——2018年向國防部高級研究機構DARPA（DARPA）提交的一項資助提案。
由美國非營利組織生態健康聯盟領導，合作者包括北卡羅來納大學病毒學家拉爾夫·巴裏克（冠狀病毒逆遺傳學先驅）和武漢病毒研究所的石正利（領導中國最大蝙蝠冠狀病毒采樣項目），DEFUSE製定了測試蝙蝠冠狀病毒刺突蛋白交換和切割位點插入的計劃。該項目從未獲得資金支持。
在疫情爆發後，提案細節曝光後，一些實驗室泄漏假說的支持者認為，DEFUSE就像是SARS-CoV-2的藍圖。他們指出病毒獨特的呋喃裂解位點——這是其最近親屬中不存在的刺突特征，能增強人類感染力和傳播能力——以及DEFUSE旨在將類似的人類特異性裂解位點插入蝙蝠冠狀病毒刺中。批評者反駁稱該提案無關緊要，因為DARPA拒絕了它。
但更根本的問題是，DEFUSE究竟是一個孤立的理念，還是已經在進行的更廣泛研究線索的一部分。
新獲得的NIH記錄表明，後來在DEFUSE中重點介紹的實驗概念——通過尖峰交換、受體結合變化和切割位點插入來調節蝙蝠冠狀病毒感染力——早在疫情爆發前多年，就已嵌入多個美國資助的新冠病毒研究項目中。
上月底，世界衛生組織新型病原體起源科學谘詢組（SAGO）成員在《自然》雜誌的一篇評論中直接回應了DEFUSE。
SAGO寫道：“即使DEFUS資助申請獲批，SARS-CoV-2從嵌合疫苗骨架中的基因組或擬議的刺突蛋白中提取出來，科學上也不太可能。”該組織強調，更廣泛的起源調查仍在進行中，關鍵數據缺口依然存在。
這些記錄，最近被美國獲得了。知情權組織，不要與SAGO關於SARS-CoV-2是否可能直接源自DEFUS提案的狹隘結論相矛盾。但他們顯示，多項研究提案已經在探索類似的方法，改變蝙蝠冠狀病毒進入細胞的方式——這些實驗旨在測試基因調整是否能擴大病毒感染新宿主（包括人類）的能力。
NIH內部審查也顯示，機構科學家認識到潛在危害。早在2016年，審稿人就警告稱，在重組冠狀病毒中修改刺針結合或切割位點可能產生“新穎且意想不到”的病毒特征，盡管類似工作在其他聯邦資助項目下仍在繼續。
文件顯示，在2019年前的幾年裏，許多概念上有明顯重疊的項目被提出、辯論、修訂、拒絕和批準，且這些研究人員多次參與其中。
當被問及更廣泛的科學生態係統是否推動蝙蝠冠狀病毒如何變得更具傳染性時，愛荷華大學冠狀病毒研究員斯坦利·珀爾曼博士表示：“這絕對正確。”“這毫無疑問。”
新公布的記錄包括奧巴馬時代暫停資助某些功能增益實驗期間的NIH內部通信，以及此前被塗黑的明尼蘇達大學郵件，這些郵件五年後仍未被塗黑。他們共同重建了美中新冠合作的運作方式以及聯邦官員如何評估風險。
許多交流的核心人物是明尼蘇達大學病毒學家方李，他的實驗室成為連接多個研究團隊的關鍵結構生物學樞紐。李在繪製刺突蛋白與受體和抗體相互作用方麵的專業知識，使他的團隊能夠識別關鍵病毒特征，而合作者則構建重組病毒、交換刺突並開展動物感染研究。
2016年，李與巴裏克的合作引起了美國國立衛生研究院內部的關注。記錄顯示，機構審查員得出結論，一項擬議的實驗改變類SARS蝙蝠冠狀病毒受體結合，可能產生風險更高的病毒——最終在聯邦功能增益資金暫停期間阻止了該研究。
“新穎且出人意料”的風險
2016年春季，白宮下令暫停對某些功能增益研究的資助正在重塑病毒學，NIH官員敦促資助申請者澄清他們的冠狀病毒實驗是否可能屬於這些限製範圍內。
該禁令適用於流感、非典和中東呼吸綜合征病毒。與人類密切相關的蝙蝠冠狀病毒有時不在暫停範圍內，因為它們尚未被證明能感染人類。
這一區分在2016年初變得尤為重要，當時NIH審查了李和巴裏克的續期申請，題為“冠狀病毒的受體識別與細胞進入”。
巴裏克是北卡羅來納大學的病毒學家，以開創冠狀病毒逆遺傳係統而聞名，多年來他與李及其他國際研究人員合作，研究冠狀病毒如何適應新宿主。
2016年3月31日，NIH通知明尼蘇達大學，Li-Baric資助可能包括暫停資助的相關研究，並要求科學家澄清任何擬議工作是否可能導致“通過呼吸途徑增強哺乳動物的致病性和/或傳播性”。
幾天後，李和巴裏奇發出了回應。
他們寫道，大部分資助內容涉及結構生物學和偽病毒係統。但其中一個組成部分——“實驗4”——提出製造帶有突變的活體重組類SARS病毒，以測試病毒感染不同物種的效率。特別是，這些實驗將測試工程化病毒利用ACE2受體——細胞表麵的蛋白質，某些冠狀病毒將其用作感染的門戶。
科學家們認為，實驗設計的受體結合力增強並不一定意味著“致病性”或病毒致病能力的增加。他們還承諾，如果工程化病毒的複製能力顯著增加，即病毒在感染細胞中增殖速度加快，將停止相關研究。
在NIH內部，該提案的審查者看到了潛在風險。
在一份內部“生物危害評論”中，一位資助經理警告說，經過基因改造以增強刺突切割或增強ACE2結合的重組冠狀病毒“可能具有新穎且意想不到的毒力表型”——或者，可能出現新的且不可預測的特征，使病毒更具危險性。
該意見建議在該提案提交機構內部功能增益監督委員會之前，允許該工作在生物安全三級防護措施下進行。
2016年5月18日，NIH官員作出了決定。
在允許其他資助部分繼續進行的同時，機構阻止了實驗4。NIH結論認為，工程化具有增強受體結合能力的類SARS病毒屬於聯邦功能增益資金暫停範圍內，“可能不會在本資助範圍內進行”，該項目負責新冠病毒資助的NIH項目官員埃裏克·斯特米博士簽署的信件中表示。
這一結論標誌著NIH早期正式得出結論，即改變蝙蝠類SARS病毒的受體結合有可能製造出更危險的病原體。
這也暴露了暫停的應用不一致。雖然NIH阻止了李和巴裏克提出的“增強親和力”實驗，但該機構允許在生態健康聯盟資助下開展相關研究，該項目涉及武漢研究所。在那個案例中，包括斯特米在內的審稿人認為，所研究的蝙蝠冠狀病毒尚未被證明能感染人類，因此不在暫停的範圍內，盡管內部對實驗存在疑問。
阻止李和巴裏奇實驗的決定並未解決更廣泛的科學辯論，也未能阻止科學家們提出類似實驗。
監管灰色地帶
盡管NIH在2016年拒絕了相關觀點，李和巴裏克仍繼續探索相關思想，聯邦政策不斷演變。
2017年3月——特朗普第一屆政府上任兩個月後——李接見了斯特米，討論一項新提案。
李寫道，巴裏克“正在考慮製造一種類似SARS的嵌合蝙蝠合成病毒。”
李轉交了一封由巴裏奇簽署的正式信件，提出一個想法：通過將一種蝙蝠樣SARS冠狀病毒SHC014的大部分與最近在烏幹達發現的另一種蝙蝠病毒的刺突蛋白結合，製造一種雜交病毒。郵件顯示，巴裏克一個月前從哥倫比亞大學病毒學家西蒙·安東尼那裏獲得了烏幹達病毒的完整序列，當時安東尼正與生態健康聯盟及其他機構合作開展PREDICT項目——這是一個由加州大學戴維斯分校研究人員領導、由美國國際開發署資助、為期十年的野生動物新興病毒編目項目。
Baric和Li的新提案還要求修改與ACE2受體結合的刺突區域——本質上是調整Uganda雜交種與不同物種細胞的附著強度。
團隊計劃測試這種工程化病毒是否能感染攜帶人類、小鼠、蝙蝠或靈貓受體的細胞。如果改造病毒複製高效，研究人員建議構建包含這些受體增強突變的完整烏幹達病毒版本。
科學家們在信中辯稱，該實驗不符合聯邦對潛在大流行病原體的定義，因為最初的蝙蝠病毒都未被證明會引起人類疾病。
他們還承諾，如果任何工程化病毒的複製性能比用作基準的SARS病毒強十倍以上，將停止相關工作。
兩周後，斯特米回複稱NIH內部委員會尚未做出決定。
他寫道，該提案已進入監管過渡階段。
“目前還沒有什麽可報告的，”斯特米寫道。“我們的內部委員會還沒開會。目前情況有些灰色地帶，因為《火之歌》的研究經費暫停在技術上仍然有效，部門正在實施取代它的P3CO政策。”
現有記錄未顯示NIH最終對烏幹達奇美拉提案作出的決定。
李和巴裏奇均未回應置評請求。NIH和斯特米也未回應有關其資助決定的問題。
這次交流展示了研究人員如何持續探索蝙蝠冠狀病毒基因組和刺突蛋白的新組合，盡管聯邦官員努力界定功能增益的界限。
綠燈在紅旗中閃爍
Li-Baric資助並非獨一無二。
在同一時期的多個項目中，NIH審查並經常批準旨在改變受體結合結構域、病毒間交換刺突蛋白或修改影響冠狀病毒感染細胞方式的切割位點的實驗。
在巴裏克和範德堡大學病毒學家馬克·丹尼森領導的資助下，研究人員提出生成小鼠適應型的SARS相關蝙蝠病毒WIV1和SHC014。內部評審指出，所得菌株在動物中可能表現出增強的致病性或傳播性。早期草稿回應質疑該工作是否符合資助目標，但後來版本準備批準實驗。
另一個Baric項目構建了帶有SHC014或WIV1刺突蛋白的SARS嵌合體。美國國立衛生研究院（NIH）當時得出結論，這些實驗未達到功能增益定義，盡管這些尖峰交換的目的是測試蝙蝠病毒是否能感染新宿主。
2015年早期的批準包括將MERS切割位點序列插入相關蝙蝠病毒HKU4，並改變受體結合區以提高病毒附著於細胞的效率。同一資助還允許對MERS切割部位進行改造——這些修改會影響病毒進入效率。
綜合來看，這些記錄顯示NIH在功能增益暫停期間阻斷了某些受體結合實驗，同時允許其他資助項目下進行密切相關的尖突交換和切割位點研究。
到2018年初，這一監管環境成為更雄心勃勃提案的背景：DEFUSE。
非正式的科學交流
日常郵件還顯示了合作者間思想和基因序列的非正式傳播。
在2018年2月的一次交流中，李向著名WIV冠狀病毒研究員施表示，巴裏奇希望獲得她未發表的一種類似MERS的蝙蝠冠狀病毒“422”刺突蛋白序列。
李寫道，他曾“提到”施氏最近與病毒的研究，巴裏克問他是否能“獲得422刺突蛋白的序列”。
“我說過我需要先和你確認一下，”李補充道。
Shi回複說，如果Baric的工作和她自己的工作沒有太多重疊，她覺得“分享信息沒問題”。她還描述了實驗室已經嚐試過的實驗。
她寫道：“我們已經在MERS-CoV骨幹上做過這種交換。”
施氏說，重組病毒可以在轉染後被拯救，但“無法在接下來的過程中生長”。
“我們暫時得停在這裏，”石補充道。“我會鼓勵他試試。”
這次交流展現了記錄中反映的協作科學生態係統，美中研究人員實時分享了序列、實驗想法和初步發現。
次月，Baric和Shi加入生態健康聯盟，向DARPA提交了DEFUS提案。
科學家們對風險展開討論
愛荷華大學冠狀病毒研究員斯坦利·珀爾曼與李合作表示，記錄中描述的更廣泛研究生態係統是真實存在的，盡管組織鬆散。
他說，研究人員試圖確定哪些蝙蝠冠狀病毒“可能感染人類細胞”，從而構成大流行風險。
與此同時，珀爾曼表示，他認為驅動嵌合體實驗的一些科學問題，往往可以用更簡單的方法來解決。
珀爾曼說：“其實不需要製造嵌合病毒來獲取一些信息，”他補充說，他相信SARS-CoV-2是自然起源的。“嵌合病毒不是我最喜歡的方式。”
另外兩位分別審查新曝光的NIH檔案的科學家則更為批評。
英國-法國病毒學家西蒙·韋恩-霍布森長期反對功能增益研究，稱巴裏克提出的一個重組病毒概念為“瘋狂”。
他說：“在《火炬》流感病毒爭議之後，”他引用了關於研究人員是否應故意讓致命病毒更具傳染性以研究它們的長達十年的辯論，“這表明巴裏奇一無所獲。”
生物信息學教授史蒂夫·馬西也審查了這些記錄，他表示這些記錄揭示了他認為一個反複出現的模式：研究人員——尤其是巴裏克——不斷突破實驗邊界，使用技術性語言“迷惑”評審者，並說服他們批準他認為屬於功能增益研究的研究。
馬西還指出了他認為的一個貫通線：在MERS中改變“人類蛋白酶切割位點”的提議，他說這類似於後來圍繞SARS-CoV-2的切割位點工程辯論。
“這類實驗很容易增強致病性或傳播性，”馬西說。“這簡直是在玩火。”
疫情後：風鈴現場測試
記錄還包括疫情初期起草的一項提案，重點關注SARS-CoV-2最具爭議的特征之一：其唄仁裂解部位。
2020年初，Baric和Li提出實驗，將該切割位點插入RaTG13——與SARS-CoV-2最為密切相關的蝙蝠冠狀病毒——以及影響刺突結合和病毒進入的突變。
目標是測試這些變化是否能讓病毒感染新物種，或使其更容易感染細胞。
研究人員承認，這類工作可能需要根據潛在大流行病原體護理與監督（P3CO）規則進行額外審查，該聯邦框架是在功能獲得資金暫停後實施的。
他們建議在嚴格的生物安全條件下進行實驗，同時開展旨在削弱病毒的功能喪失研究。
但提案也明確指出了科學家們對突變可能帶來的影響。
研究人員寫道：“我們預計，將風鈴切割位點插入RaTG13可能會增強病毒感染和引發活體疾病的能力。”
記錄顯示的內容
新披露的文件並未證明SARS-CoV-2是被設計或從實驗室逸出的。
但這些報告提供了當代證據，表明研究人員和聯邦官員在疫情爆發前多年就已如何思考冠狀病毒工程。
NIH評審員警告稱，改造刺突蛋白可能會產生“新穎且意想不到”的病毒性狀。科學家們爭論這些實驗應該走多遠。多個資助項目中出現了重塑受體結合或切割位點的提案。
到疫情爆發時，甚至在DEFUSE被否決之前，調校冠狀病毒進入人體細胞的工具和科學概念已不再是推測性的。這些提案已經被提出，在聯邦監督信中被辯論，並通過國際合作實驗室網絡進行推進。
劉易斯·坎布是美國新聞機構的調查記者。知情權。他是NBC新聞首位全國性的FOIA記者，並在《西雅圖時報》工作近十年，期間參與報道團隊，因揭露波音737 MAX墜機事故背後的失敗而獲得普利策獎。
