活體光學腦成像與神經科學研究

     活體光學腦成像是指動物在活體狀態下，利用光學手段對腦內某種特定結構或功能進行成像並對圖像進行收集和分析的過程。 圖像產生於熒光信號，熒光信號可以是自發熒光或人工標記熒光。 人工標記熒光是目前活體光學成像的主要手段，它的產生可以通過化學或生物方式。化學標記是指利用帶有熒光集團的有機物與某種細胞、亞細胞結構或細胞內離子的特異性結合來進行成像的手段；生物方式， 可以應用病毒感染或構建轉基因動物的方法，在神經細胞內表達特異性熒光蛋白，這種熒光蛋白通常是指示器蛋白，即它的熒光信號可以反應某一特定的生物學過程，這樣通過對熒光信號的記錄，就可以對某一特定的細胞結構或功能進行成像研究。

     大體上來講，活體光學腦成像分為細胞或亞細胞水平成像和廣域成像兩大類。細胞水平成像主要應用雙光子顯微鏡，在一個較小範圍的腦皮層內（一般小於1×1mm²）對標記的細胞、亞細胞結構或鈣離子濃度變化進行成像。 由於神經細胞內鈣離子水平驟然升高反應動作電位的形成，因此神經元鈣離子成像成為在細胞水平觀察神經元放電主要手段；另外一種是廣域成像，指在一個較大的腦皮層區域內（以小鼠為例，可達8×8mm²）^【1】，對某一個腦區或數個腦區的神經電活動，從介觀的水平進行觀察。盡管它不能觀察到單一神經元的放電活動，但對於了解腦作為一個整體的功能，例如在自發或感覺誘發狀態下，神經網絡模式的變化，具有特殊的優勢.

        神經元鈣成像       神經元內鈣離子濃度的驟然增加是神經元動作電位的標誌，通過熒光標記來顯示細胞內鈣離子濃度的變化，從而了解個體神經元的放電過程，是神經元鈣成像的基本原理。早期的神經元鈣成像應用有機熒光染料與鈣離子的特異性結合而顯示鈣離子濃度的變化，其缺點是有機熒光染料代謝快，因此難以在長時間內觀察神經元的放電特征。GCaMP的出現使鈣離子成像技術發生了革命性的改變. GCaMP是由綠色熒光蛋白、鈣調蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶的一段肽鏈組合成的一個融合蛋白, 具有鈣離子指示器的功能, 它可以感受細胞內鈣離子濃度的變化, 發出相應的熒光信號。通過病毒轉染技術,可以在腦特定皮層區域的神經元內表達這種蛋白, 運用雙光子顯微鏡技術,就能在活體情況下觀察到神經元鈣離子的圖像信息,從而將神經元的放電顯示在圖像中。由於病毒轉染後可以穩定表達數月時間,因此可以進行長時間的圖像研究。通過轉基因技術使GCaMP穩定表達於動物基因組中，通過與不同的啟動子連接，既可以使GCaMP表達在所有神經元中，也可以在腦皮層的特定層次選擇性地表達。GCaMP小鼠已經成為神經元鈣成像的主要研究工具，應用非常廣泛。舉例來說，以往研究位置細胞主要應用電生理結合動物位置點記錄，其缺點是單一細胞記錄。如果將鈣離子成像技術和位置點記錄結合，就可以同時在一個活體動物上記錄到數百個位置細胞^【2】；如果擴大開顱的範圍，則可以在更為廣泛的腦皮層範圍來尋找位置相關細胞。另外，可以把鈣離子成像技術和傳統的動物行為學研究手段結合，來研究感興趣腦區的功能，比如學習記憶與海馬皮質，行為決定與前額皮質，位置信息處理與壓後皮質等等。

          樹突和樹突棘成像     利用高分辨率的雙光子顯微鏡， 可以在表達綠色或黃色熒光蛋白的神經元中清晰地顯示樹突和樹突棘等結構。樹突棘是軸-樹突觸結構中形成突觸後膜的結構。如果對活體動物腦內某一區域腦皮層的樹突棘進行動態觀察，在一段時間內了解其形成和消失的動態變化過程，則在一定程度反應了突觸結構的變化。突觸是神經元聯係的主要方式，突觸的動態改變反應了神經元結構上的可塑性，與學習記憶過程密切相關。如果將動物行為學研究（如記憶的形成）或動物疾病模型（如早老性癡呆）與樹突棘成像結合^【3】，就可以對記憶形成的結構基礎或早老性癡呆的顯微病理解剖改變有更為深入的認識。

          血管和血管神經單位成像    通過向動物靜脈內注射熒光染料標記的葡聚糖，可以在活體狀態下清晰地顯露腦血管的結構，測量微血管管徑，紅細胞流速等指標；如果用有機染料如Rhod2-AM.或轉基因技術特異性的標記星型膠質細胞內的鈣離子，則可以顯示微血管和星型膠質細胞足突形成的血管神經單位^【4】。是活體狀態下研究微血管神經單位、血腦屏障動態變化的有力手段，可應用於腦卒中、腦創傷和腦腫瘤的研究。

         神經發生成像      通過特異性標記海馬神經前體細胞，顯微手術暴露海馬CA1 區域，就可以在雙光子顯微鏡下動態觀察活體小鼠海馬區神經前體細胞的增殖、遷移和分化過程， 對深入了解成體海馬的神經發生有著重要意義^【5】。

          電壓敏感性染料活體成像        這是一種廣域成像技術。電壓敏感性染料是一種可以和細胞膜特異性結合的有機熒光物質，它可以嵌入到細胞膜的磷脂雙分子層中，感受快速變化的膜電位變化，並依據膜電位的高低，釋放出相應強度的熒光信號。通過快速照相機的攝取，就可以獲取與膜電位變化相關的動態圖像。其時間分辨率可以達到毫秒級別，空間分辨率也可以達到50微米。盡管不是細胞水平的成像，但是由於使用照相機技術，就可以在一個更大的範圍內記錄腦皮層局部場電位的變化。比如在小鼠， 最大可以在8×8mm² 的範圍內進行記錄，這幾乎包括了大部分背側腦皮層區域。腦的功能活動，比如感覺信息處理，認知，學習和記憶以及行為決定等都是一個眾多腦區域共同參與的過程，因此在一個較為廣泛的區域內記錄局部場電位的變化，對於了解不同腦皮層區之間的相互聯係以及神經網絡模式的形成和變化有著極為重要的意義。例如，通過對不同感覺形式刺激下腦皮層反應模式變化的特征觀察，發現不同刺激形式下，皮層的反應模式具有類似的特征，即神經衝動具有從初級感覺區向聯絡區皮層傳遞的特點，這種神經網絡模式也可見於沒有刺激下的自發放電^【1】。結合光遺傳學技術，可以研究直接腦皮層在激光刺激情況下神經網絡模式的變化^【6】。

          慢性廣域成像     不同於電壓敏感性染料活體成像，慢性廣域成像應用轉基因動物，在神經元內表達熒光標記的膜電位敏感蛋白、神經遞質穀氨酸濃度指示蛋白或鈣離子敏感蛋白，通過感受膜電位變化、穀氨酸釋放或鈣離子濃度變化，反應神經元的電活動。由於熒光信號強，不需要移除顱骨也可以記錄信號，所以隻需將頭皮和軟組織去除後就可以在一個較大範圍成像^[7]。盡管這種技術在時空分辨率上與傳統的電壓敏感性染料成像還有差距， 但它最大的優點是可以在一個相當長的時間（數月）進行清醒記錄，因此可以把廣域成像技術與行為學研究結合。例如研究動物在學習記憶過程中腦電活動在介觀水平上的變化。

           活體光學成像技術的發展雖然隻有數十年，但已經顯示了其記錄範圍廣闊、時空分辨率高等優點。它可以與傳統的行為學研究、電生理技術結合，也可以與現代光遺傳學技術結合，在神經科學研究中起著越來越重要的作用。現代顯微鏡技術的快速發展使大範圍和深部腦結構成像成為可能；隨著小型顯微鏡（Miniscope）技術的發展，結合自聚焦透鏡（Gin lens）,可以在動物自由活動時進行深部腦結構的細胞水平成像^【8】，這種技術在神經科學研究中顯示了巨大的潛力。

參考文獻

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2. Mao D, Neumann AR, Sun J, Bonin V, Mohajerani MH, McNaughton BL (2018) Hippocampus-dependent emergence of spatial sequence coding in retrosplenial cortex. PNAS, 115(31):8015-8018.

 

3. Chengyu Zou1,  Yuan Shi1, · Jasmin Ohli · Ulrich Schüller .Mario M. Dorostkar · Jochen Herms1. Neuroinflammation impairs adaptive structural plasticity of dendritic spines in a preclinical model of Alzheimer’s disease. Acta Neuropathol DOI 10.1007/s00401-015-1527-8.

 

4. Cam Ha T. Tran and Grant R. Gordon* Acute two-photon imaging of the neurovascular unit in the cortex of active mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. February 2015 Volume9 Article11 .

 

5. Pilz GA, Bottes S, Betizeau M, Jörg DJ, Carta S, Simons BD, Helmchen F, Jessberger S. Live imaging of neurogenesis inthe adult mouse hippocampus. Science. 2018 Feb 9;359(6376):658-662.

 

6. Lim DH, LeDue J, Mohajerani MH, Vanni MP, Murphy TH (2013). Optogenetic approaches for functional mouse brain mapping. Frontiers in Neuroscience 10;7:54 PMID: 23596383.

 

7. Silasi G, Xiao D, Vanni MP, Chen AC, Murphy TH. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. J Neurosci Methods. 2016 Jul 15;267:141-9. doi: 10.1016/j.jneumeth.2016.04.012. Epub 2016 Apr 19.

 

8. Zhang L, Liang B, Barbera G, Hawes S, Zhang Y, Stump K, Baum I, Yang Y, Li Y^1,4, Lin DT^1,5. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Curr Protoc Neurosci. 2019 Jan;86(1):e56. doi: 10.1002/cpns.56. Epub 2018 Oct 13.