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文章來源: 科技在線
SARS-CoV-2的特征之一即為在S1和S2的交界處有一個四氨基酸的插入，這種被稱為弗林蛋白酶剪切位點的插入是SARS-CoV-2獨有的。研究團隊此番在RmYN02中S1和S2交界處也發現插入了三個殘基PAA， “雖然SARS-CoV-2插入的殘基(以及由此產生的核苷酸)與RmYN02中的殘基不同，但可以表明它們是一個獨立的插入事件，它們在野生動物(蝙蝠)中出現強烈表明它們是自然起源的，可能是通過重組獲得的。”
最新的一項研究顯示，去年在雲南猛臘縣獲得的蝙蝠樣本中發現一種新冠狀病毒，該病毒在最長編碼基因區1ab與新冠病毒（SARS-CoV-2）一致性達到97.2%。同時，研究團隊在這一新冠狀病毒中S蛋白（刺突糖蛋白）S1和S2交界處也發現插入了三個殘基PAA，他們由此認為SARS-CoV-2在S1和S2的交界處的四氨基酸插入並非“人工痕跡”，有力證明了其起源於自然。
當地時間5月10日，《細胞》（Cell）旗下子刊《現代生物學》（Current Biology）在線發表了“A novel bat coronavirus closely related to SARS-CoV-2 contains natural insertions at the S1/S2 cleavage site of the spike protein ”，來自山東第一醫科大學、山東省高等學校新發傳染病病因流行病學實驗室、中國科學院西雙版納熱帶植物園、中國科學院北京生命科學研究所、中國科學院武漢病毒研究所、中國科學院微生物研究所、澳大利亞悉尼大學聯合團隊的研究人員給出了上述結論。
在這篇論文中，研究團隊報告了一種新的蝙蝠來源冠狀病毒，命名為RmYN02，是在2019年5月至10月期間從中國雲南省收集的227隻蝙蝠的基因組分析中鑒定出來的。
研究顯示，RmYN02和新型冠狀病毒SARS-CoV-2在全病毒基因組中的同源性為93.3%，在與SARS-CoV-2最接近的1ab基因中的同源性為97.2%。相比之下，RmYN02受體結合域（RBD）與SARS-CoV-2之間呈現低序列同源性（61.3%），可能不與血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合。
然而，與SARS-CoV-2相似，RmYN02的特點是在S蛋白的S1和S2亞單位的剪切位點處有多個氨基酸插入。研究團隊認為，這就有力證明了這種插入事件在自然界中是可以發生的。
這些數據表明，SARS-CoV-2源於蝙蝠和其他野生動物中存在的病毒之間的多重自然重組。
該論文通訊作者為山東第一醫科大學基礎醫學院病原生物學研究所所長、山東省高等學校新發傳染病病因流行病學實驗室主任史衛峰，中國科學院微生物研究所病毒傳播預警與致病機製研究組組長、項目研究員畢玉海，中國科學院西雙版納熱帶植物園綜合保護中心景觀生態組組長、副教授Alice Catherine Hughes。該研究此前於當地時間3月5日發表在預印本網站bioRxiv上。
新冠病毒起源尚不明確，野生動物中仍有大量冠狀病毒
SARS-CoV-2在中國及其他地區造成了前所未有的肺炎流行，已引起全球範圍的公共衛生關注。盡管蝙蝠被認為是SARS-CoV-2 最有可能的自然宿主，但病毒的起源仍不清楚。
係統發育分析表明，SARS-CoV-2是一種不同於SARS-CoV和MERS-CoV的新型冠狀病毒。到目前為止，與SARS-CoV-2最密切相關的病毒是RaTG13，它是中科院武漢病毒所石正麗團隊於2013年在雲南采集的一隻中華菊頭蝠標本中分離發現。RaTG13病毒株和新冠病毒具有96.1%的核苷酸同源性、92.9%的S基因同源性。這些數據再次說明蝙蝠是冠狀病毒的重要宿主。
然而，值得注意的是，香港大學公共衛生學院新發傳染病國家重點實驗室管軼教授、廣西醫科大學胡豔玲教授團隊，以及華南農業大學、嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室沈永義教授、肖立華教授團隊兩個研究小組此前均報告了存在於馬來穿山甲的SARS-CoV-2相關冠狀病毒，這些穿山甲通過非法走私進入廣西和廣東。
研究團隊提到，盡管在全基因組水平上，這些穿山甲中檢測到的冠狀病毒與SARS-CoV-2的距離要遠於RaTG13與SARS-CoV-2的距離，但它們在S蛋白的受體結合域(RBD)上與SARS-CoV-2非常相似。
因此，盡管目前還不清楚穿山甲是否是SARS-CoV-2傳播到人過程中的中間宿主，但它們可能在冠狀病毒的生態學和進化中發揮重要作用。
他們認為，這些在穿山甲中發現的病毒可以表明，在野生動物中仍有大量的冠狀病毒樣本，其中一些可能直接參與了SARS-CoV-2的出現。
SARS-CoV-2和幾種代表性蝙蝠來源冠狀病毒序列比較。
一種新的蝙蝠來源冠狀病毒，命名RmYN02
論文中提到，2019年5月至10月,研究團隊從雲南猛臘縣的227隻蝙蝠中一共收集了302個樣本。這些蝙蝠屬於20個不同種類，大多數樣本從馬來菊頭蝠Rhinolophus malayanus（n=48, 21.1%）、中蹄蝠Hipposideros larvatus （n=41，18.1%）和小褐菊頭蝠Rhinolophus stheno（n=39,17.2%)中獲得。樣本來源於多種組織，包括翼膜（219）、肺（2）、肝（3）和糞便（78）。
除了3隻蝙蝠外，其餘所有蝙蝠均為在活著時取樣並被釋放。
利用新一代宏基因組測序技術，研究團隊首先鎖定了2個初步的一致序列。這些序列產生的樣本來自於2019年5月6日至7月30日期間的11份馬來菊頭蝠糞便。經過一係列驗證步驟，研究團隊得到一個部分（23395bp）和一個完整（29671bp）的蝙蝠冠狀病毒基因組序列，分別命名為BetaCoV/Rm/Yunnan/YN01/2019 （RmYN01）和BetaCoV/Rm/Yunnan/YN02/2019 （RmYN02）。
相比之下，RmYN02與SARS-CoV-2密切相關，表現出93.3%的核苷酸序列一致性，但從全長基因組層麵來說，RaTG13和SARS-CoV-2的一致性更高(96.1%)。RmYN02和SARS-CoV-2在大多數基因組區域(如1ab、3a、E、6、7a、N和10)非常相似（>96%序列一致性）。特別是，RmYN02在最長編碼基因區1ab (n=21285)與SARS-CoV-2一致性達到97.2%。
不過，RmYN02和SARS-CoV-2在S基因中的序列一致性（核苷酸71.8%，氨基酸72.9%）遠低於RaTG13和SARS-CoV-2之間的97.4%。另外值得注意的是，RmYN02和SARS-CoV-2在RBD中的氨基酸同源性僅為62.4%。而來自廣東的穿山甲冠狀病毒和SARS-CoV-2在RBD中的氨基酸同源性為97.4%，也是在RBD區域目前和SARS-CoV-2最接近的。
圍繞SARS-CoV-2的同源模型、體外實驗和S蛋白的三維結構分析結果都表明，SARS-CoV-2和SARS-CoV一樣，也可以利用ACE2作為細胞受體。研究團隊也同樣使用同源模型分析了RmYN02、RaTG13和兩個穿山甲CoVs的RBD。
RmYN02和代表性冠狀病毒RBD結構的同源建模和結構比較。
研究發現，RmYN02 RBD中的氨基酸缺失在受體結合位點附近形成了兩個比SARS-CoV-2 RBD短的環。重要的是，在SARS-CoV、SARS-CoV-2、RaTG13、穿山甲/MP789/2019、穿山甲/GX/P5L/2017的外子域（external subdomain ）保守的二硫鍵在RmYN02中缺失了。研究團隊推測，這些缺失可能導致構象變化，從而減少RmYN02 RBD與ACE2的結合，甚至導致不結合。
當然也有可能的一種情況是，包括RmYN02、ZXC21和ZC45在內的環缺失的SARS相關冠狀病毒，使用了一種我們目前未知的受體。
值得一提的是，此前有研究認為，RBD中的6個氨基酸殘基(L455、F486、Q493、S494、N501和Y505)是SARS-CoV-2與ACE2有效受體結合的主要決定因素。與同源建模一致，穿山甲/MP789/2019在所有6個位置上都具有與SARS-CoV-2相同的氨基酸殘基。相比之下，RaTG13、RmYN02和RmYN01與SARS-CoV-2均隻在1個位置上有相同的氨基酸殘基。
研究團隊認為，這種進化模式是重組和自然選擇的複雜結合的表現。
係統發育樹：A 全長基因組；B、S基因；C、RBD ；D、RdRp(RNA依賴的RNA聚合酶
研究團隊還對RmYN02、RaTG13、SARS-CoV-2和穿山甲中的蝙蝠冠狀病毒進行了係統發育分析。與先前的研究相符，穿山甲beta-CoVs形成兩個亞型。然而，論文中提到，穿山甲是否是這些病毒的天然蓄水池，或者它們從蝙蝠或其他野生動物中獨立獲得，這都需要進一步驗證。
更值得注意的是，在大多數病毒基因組中，RmYN02與SARS-CoV-2的親緣關係最近，盡管這兩種病毒之間仍然有一段較長的分支距離。S基因樹顯示，SARS-CoV-2離RaTG13較近，和RmYN02較遠，這表明後者在S基因經曆了重組。在RBD的係統發育樹上，SARS-CoV-2和pangolin-CoV/GD最密切相關，與蝙蝠病毒都較遠，再次表明重組發生。最後，完整的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)基因(在RNA病毒的係統發育分析中經常被使用)係統發育分析顯示，RmYN02、RaTG13和SARS-CoV-2形成了一個與穿山甲病毒完全不同的亞群。
SARS-CoV-2是自然起源，可能通過重組獲得
類似禽流感病毒(AIVs)血凝素(HA)蛋白的方式，冠狀病毒的S蛋白在功能上分裂成兩個亞基S1和S2。而在某些AIV亞型的剪切位點上插入多堿基氨基酸被認為與增強致病性有關。
值得注意的是，SARS-CoV-2的特征之一即為在S1和S2的交界處有一個四氨基酸的插入，這在其他β冠狀病毒的其他譜係中沒有觀察到過。這種被稱為弗林蛋白酶剪切位點的插入是SARS-CoV-2獨有的，目前在所有檢測的SARS-CoV-2序列中都發現存在。
研究團隊此番在RmYN02中S1和S2交界處也發現插入了三個殘基PAA，他們認為這是非常重要的。“雖然SARS-CoV-2插入的殘基(以及由此產生的核苷酸)與RmYN02中的殘基不同，但可以表明它們是一個獨立的插入事件，它們在野生動物(蝙蝠)中出現強烈表明它們是自然起源的，可能是通過重組獲得的。”
因此，這些數據有力地表明了SARS-CoV-2的自然起源。
此外，研究團隊再次確定了RmYN02的蝙蝠宿主為馬來菊頭蝠（Rhinolophus malayanus），和一種馬來菊頭蝠標本中獲得的序列（GenBank accession MK900703 ）100%一致。
馬來菊頭蝠和中華菊頭蝠都廣泛分布於中國西南部和東南亞地區。論文中提到，一般來說，這些蝙蝠不會長距離遷移，群居性很強，很可能生活在同一個洞穴中，這可能會促進它們之間的病毒交換和重組的發生。
值得注意的是，科學家從肛門拭子中發現了RaTG13，從糞便中發現了RmYN02。因此，糞便是蝙蝠將病毒傳播給其他動物，特別是能夠利用洞穴環境的物種的一種簡單但可行的方法。
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石正麗團隊2年前已發現蝙蝠冠狀病毒感染人現象
記者盤點近年研究成果發現，蝙蝠SARSr-CoV或其他潛在病毒感染人類的首份血清學證據，兩年前已得出。
2017年11月底到2018年2月，中科院武漢病毒研究所研究員石正麗團隊連續發表3篇論文，表示已發現SARS相關冠狀病毒在蝙蝠體內重組的證據，以及人類感染蝙蝠的SARS相關冠狀病毒的現象。
石正麗團隊通過對雲南218位村民的血清測試，提示SARS類冠狀病毒有很高的潛力直接感染人，而無需中間宿主。論文還預測，蝙蝠體內的SARS相關冠狀病毒“溢出”到人類體內後，可能會引起類似SARS的疾病，建議對相關地區加強監測。
蝙蝠冠狀病毒有無直接傳人證據？
218雲南村民血清采樣，6人陽性
近日引發關注的報道中，援引了美國瓦克斯曼微生物研究所所長Richard Ebright教授的解釋，稱中國菊頭蝠的ACE2受體與人體的ACE2受體的相似程度與其他潛在中間宿主是一樣的，這表明這次感染了數萬人的疫情的源頭可能直接來自蝙蝠。
該報道直指中科院武漢病毒研究所研究員石正麗團隊兩年前做的研究。2017年11月底到2018年2月，石正麗團隊連續發表3篇論文（發布平台、中英文名見文末備注），揭示了以雲南采樣的蝙蝠體內SARS相關冠狀病毒的連貫研究成果。
論文通過相關證據，鎖定了SARS病毒的源頭宿主是蝙蝠。同時，發現SARS類冠狀病毒有很高的潛力直接感染人，而無需中間宿主。
為進行人類感染蝙蝠SARS相關冠狀病毒的血清檢測，在2015年10月，石正麗團隊在雲南省昆明市晉寧區夕陽彝族鄉4個村莊（天井，大風口，綠溪，綠溪新村）收集了218個居民的血清樣本。附近有2個蝙蝠洞（燕子洞和石頭洞），距離4個村莊在1.1-6.0公裏之間。自2011年以來，石正麗團隊一直在對這些洞穴中存在冠狀病毒的蝙蝠進行縱向分子監視，並發現大量蝙蝠居住，包括被證明是SARS相關病毒主要宿主的菊頭蝠（石正麗團隊日前發現的與新冠病毒最接近的病毒樣本，也采自菊頭蝠）。
這個地區沒有經曆過2002-2003年SARS的暴發，他們在采樣過程中也沒有受試者表現出任何明顯的呼吸道疾病。在這些樣本中，女性有139名，男性有79名，中位年齡是48歲。有208人提供了職業數據（占95.4％）：其中85.3％為農民，8.7％為學生。大部分被調查者（81.2％）飼養或擁有牲畜或寵物，並且大多數被調查者（97.2％）曾接觸或接觸牲畜或野生動物。其中，有20名（9.1％）參與者目睹了蝙蝠在房屋附近飛行，其中一人處理過蝙蝠屍體。
這218個人中，有6人在SARS相關冠狀病毒的檢測中呈陽性，但是對他們的口腔和糞便拭子及血細胞中進行的病毒核酸檢測都沒有陽性。
石正麗團隊在論文中表示，他們的研究提供了蝙蝠SARSr-CoV或潛在相關病毒可能感染人類的首份血清學證據。
被調查者感染來源如何鎖定？
6人未接觸SARS患者，1人去過深圳
論文介紹了六個陽性樣本（四名男性，兩名女性）的人口學統計和旅行史。
其中，大風口村有兩名男性（45歲的JN162、51歲的JN129）；綠溪村兩名男子（JN117，49歲，JN059，57歲）；兩名女性（分別是55歲的JN053，JN041）來自天井村。在采樣之前的12個月中，JN041是唯一一位有雲南之外旅行史的人，她到過深圳，距離她的家鄉1400公裏。JN053和JN059隻去過距離他們村莊1.4公裏的地方。JN162前往過63公裏外的雲南省會昆明。JN129和JN117從未離開村莊。6人都提到，曾看到蝙蝠在他們的村莊中飛行。
這6名被調查者沒有接觸過SARS患者，也沒有在SARS疫情暴發期間去過SARS重疫區，並且，感染SARS的康複者2-3年體內可檢測抗體迅速下降，這也說明這些陽性不是由於先前感染過SARS引起的。
論文稱，對於居住在蝙蝠群落附近高危人群的血清陽性率為2.7％，這表明蝙蝠體內病毒溢出是相對罕見的事件，但是這取決於抗體在人體內存在的時間，其他人的抗體可能已經減弱（以致無法檢出）。
6人在受訪時均表示，在調查之前的12個月中沒有任何臨床症狀。基於細胞和人源化小鼠感染研究表明，這些病毒的毒性不如SARS病毒。石正麗團隊稱，考慮到這些人在村裏極有可能直接接觸蝙蝠的分泌物，因此他們的研究說明，一些蝙蝠體內的SARS相關冠狀病毒不用經過中間宿主，就能夠直接感染人類。
蝙蝠體內病毒會否頻繁演變？
洞穴內存在多種蝙蝠，經常發生病毒重組
在另一篇論文中，石正麗團隊稱，他們研究的洞穴距離昆明市約60公裏。 除了已經檢測出SARS相關病毒的許多菊頭蝠和蹄蝠之外，那裏還存在其他蝙蝠，如鼠耳蝠。洞穴的溫度約為22℃–25℃，濕度約為85％-90％。 洞穴的物理性質並不是唯一的，但是在繁殖季節，它確實容納了特別密集的蝙蝠種群。在雲南其他地區，不同物種的蝙蝠種群共同居住的類似洞穴並不罕見。
從一項為期5年的縱向研究中得出的結論最終證明，SARS病毒基因組的所有構成要素都來自雲南一個地方的蝙蝠SARS相關冠狀病毒。菊頭蝠被認為是SARS病毒的主要天然宿主，因為在它們體內有與SARS病毒高度同源的所有SARS相關冠狀病毒。細胞侵入研究表明，三種不同S蛋白序列的SARS相關冠狀病毒都能夠使用人的ACE2（一種細胞受體，SARS和新冠病毒目前都被證明可以結合ACE2，從而侵入細胞）作為受體。
數據表明，在同一洞穴中的SARS相關冠狀病毒之間經常發生重組事件。石正麗團隊證明，SARS病毒最有可能是通過菊頭蝠體內的SARS相關冠狀病毒重組產生。 此外，他們還發現，能夠結合人類ACE2的各種SARS相關冠狀病毒在這個區域的蝙蝠中交叉傳染。 因此，蝙蝠體內的冠狀病毒有可能“溢出”給人類，並出現類似SARS的疾病。
石正麗調查的蝙蝠洞離最近的村莊隻有1.1公裏，本地居民可能會接觸到蝙蝠。 他們建議應繼續監控該點位和其他點位的SARS相關病毒的演變，檢查人類感染的風險和對村民進行血清學調查，以確定這些點位是否已經發生感染並製定幹預策略，避免將來引發疾病。
蝙蝠冠狀病毒傳人的風險有多大？
東南亞部分地區食用蝙蝠
石正麗團隊還對2009-2016年在雲南和廣東省采集的果蝠樣品中的兩種beta冠狀病毒進行了縱向監測。
論文提到，蝙蝠是唯一能夠飛行的哺乳動物，約占所有哺乳動物的20％。根據飲食的差異，蝙蝠分為食蟲類和食果類。果蝠因為體型龐大、肉質肥厚，被非洲和東南亞一些地區的人當作美味（ideal bushmeat）。
非洲和太平洋地區的果蝠寄生多種病毒，例如馬爾堡病毒、亨德拉病毒和尼帕病毒。與免疫係統相關的亨德拉病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒和狂犬病毒，已經在中國的果蝠中被檢測到。此外，還從果蝠中檢測到或分離出遺傳物質多樣的呼吸道腸道病毒、腺病毒和冠狀病毒。
分別在廣東省和雲南省發現的兩個密切相關但截然不同的beta冠狀病毒（SARS和新冠病毒也屬於這類病毒。——記者注）。兩者都在中國的黑果蝙蝠中發現，冠狀病毒可通過呼吸係統和腸道感染宿主。石正麗團隊研究發現，腸道組織是兩種beta冠狀病毒的主要靶標。但是，在腎髒和肺部也檢測到其中一種beta冠狀病毒，這表明這種beta冠狀病毒具有廣泛的組織嗜性，並可能通過糞便和呼吸道傳播，從而感染其他動物。
石正麗團隊在論文中表示，中國至少有五種果蝠，全部位於熱帶地區。這些果蝠以水果和花朵為食，並與農民、農場頻繁接觸，因此增加了蝙蝠病毒向家畜和人類傳播的風險。
科研人員是否存在感染風險？
采集樣本易接觸蝙蝠排泄物
武漢晚報2017年5月曾報道武漢市疾病預防控製中心田俊華，為科研冒著被感染風險野外捕捉蝙蝠的事跡。
報道稱，采集蝙蝠樣本的環境極其惡劣。蝙蝠洞內散發著惡臭，而且在懸崖峭壁上，極其危險；蝙蝠攜帶大量病毒，一不小心就有被感染的風險。
田俊華發現利用發出的煙火和響聲驚動蝙蝠促使其活動、再拉網，捕獲的蝙蝠最多。“但在操作中，田俊華忘記了做防護措施，蝙蝠尿液像雨點從頭頂滴到他身上”，“蝙蝠的翅膀攜帶利爪，抓蝙蝠時需要用夾子，大蝙蝠被夾傷後很容易噴血；好幾次蝙蝠血直接噴在了田俊華皮膚上”。
在央視“曠野青春”係列科普紀錄片中，田俊華也介紹“如果我們皮膚裸露，很容易接觸到蝙蝠的排泄物，汙染的物體”。
田俊華知道有被感染風險，回家後會主動和妻兒保持距離，自我隔離14天。按照石正麗團隊此前的研究，接觸蝙蝠的分泌物，有很大幾率被感染冠狀病毒。
一篇發表在2013年Emerg Infect Dis（新型傳染病）的論文顯示，在泰國采集蝙蝠糞樣本的beta冠狀病毒呈陽性，建議收集蝙蝠糞的工人使用個人衛生的預防措施並改善屏障保護，以減少接觸人畜共患病原體的可能性。
果子狸
論文作者之一的美國生態學家Kevin Olival曾在中國和亞洲其他地方采集過蝙蝠樣本，他在接受國家地理雜誌采訪時稱，冠狀病毒不僅通過空氣和呼吸道傳播，也可能存在口糞傳播。蝙蝠並不是很幹淨，如果一個水果被蝙蝠糞便汙染，並掉到地上，可能就會交叉感染飼養動物（如果子狸）。
備注：
2017年11月底到2018年2月，石正麗團隊在美國生物學期刊PLOS Pathogens（《病原學》）、武漢病毒研究所英文期刊Virologica Sinica （《中國病毒學》）發表3篇論文，分別是Discovery of a rich gene pool of bat SARS- related coronaviruses provides new insights into the origin of SARS coronavirus（《蝙蝠SARS相關冠狀病毒豐富基因庫的發現，為研究SARS病毒的起源提供了新的見解》）、Longitudinal Surveillance of Betacoronaviruses in Fruit Bats in Yunnan Province, China During 2009–2016（《2009-2016年間雲南省果蝠中Beta冠狀病毒的縱向監測》）、Serological Evidence of Bat SARS-Related Coronavirus Infection in Humans, China（《人類感染蝙蝠SARS相關冠狀病毒的血清學證據》）。
