波城新語 - 笑人也笑己，笑笑無壞意， 讀讀就算了，千萬別生氣！
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小顏登頂的人梯
科學的進步曆來都不是前人栽樹後人乘涼，而是一個前人為後來者搭人梯的過程，這麽說不矛盾，因為這個意味著後人雖然因前人的工作受益，但他們卻不能停下來坐享其成，而是要繼續攀越，隻有這樣，科學才能發展和進步，不然大家隻能活在CS中，變得愚昧落後。
小顏在葡萄糖轉運體方麵研究的成功也是借著前人搭的梯子攀登上去的。沒有這個梯子，她的工作不是不可能，因為她用的工具X-光晶體結構分析能夠直接看到蛋白的結構，但是這些人積累的知識卻為她提出這個結構和機理增加了信心和佐證。
這幾天城裏人進行了一場大討論，就是小顏在攀登高峰時踩的人梯有沒有踩在大Yan那厚實的肩膀上。城裏很多人相信她踩了，隻是沒有承認而已，現在被追問了，還說沒踩，不僅說沒踩，還有點不耐煩。城裏另外一部分人則說她沒踩，當時雖然看見大Yan的肩膀了，但不在她捷徑上，所以沒有彎過去踩他一腳，我屬於後麵這部分人中的一頑固分子。
在發多文後，依然有人覺得小Yan還是踩了大Yan的肩，為了看看她到底有沒有踩，我們不妨來看看一篇由Mike M. Mueckler和Paul W. Hruz寫的一篇關於《Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter》的綜述，我想和大家一起學學這篇文章，是因為這裏麵詳細地記錄一直到2009年對GLUT1的結構和功能研究的曆史，這就是小Yan的研究方向和最終目的 （2012年左右開始暫露頭角）。
我認為該文寫得很好，是因為他們從一級結構一直講到四元結構。一級就是直線的，意思就是說氨基酸序列和根據其推測的重要功能基團；二級結構就是在在直線的基礎上的彎曲，這裏重點是螺旋；三級結構是螺旋在三維空間裏是怎麽排列的；四元結構這裏指的是單體，二聚體還是多聚體。除了幾段我覺得對這些結構和機理的文可有可無而沒有放上來外，關鍵的部分我和穀哥都把它門列上了，目的是為了看看那些為小Yan搭人梯的肩膀，最主要的就是看看有沒有大Yan那寬厚的雙肩。
一直到2009年的人梯中的肩膀基本上都看了，一共差不多有幾百個肩膀，就是沒有大Yan的 （如果有大Yan的肩膀，應該在93年/Cell paper和95年/PNAS paper之間），為什麽？還是因為大Yan的肩膀在另外一個人梯裏，不在小Yan走的捷徑上，她就沒有彎過去踩他一下，希望吃瓜群眾看了這個以後，不要再跟風罵人家小Yan了，更不要打假，因為她的東西比前麵所有人的幹貨都多。
所以，她沒有彎道超車，不然就會睬著大Yan的肩膀了，因為她走的是捷徑，所以沒有彎過去踩大Yan一腳，明白了吧！
她的工作為什麽那麽重要，就是因為大家在用野路子連摸帶猜辛辛苦苦多年後還不知道猜的結構到底是不是正確的時候，都一直都盼著像她那樣的具有確定性的工作，就像綜述最後說的: "雖然目前的關於GLUT1的結構/功能關係，包括圖中（原文圖三）顯示的GLUT蛋白三級結構的模型的研究工作讓人印象深刻，但所有的知識體係都仍然是推測性的。結構的最終確認必須等待技術進步，這些技術包括能讓“促進轉運蛋白”結晶和/或能純化足夠的功能蛋白用以在溶液狀態進行結構分析。"
打個比方，大Yan和他那個時候走野路子的人就像是在盲人摸象，沒有眼睛，摸來摸去，還是不知道大象到底什麽熊樣，而小Yan的X-光晶體技術就像是她的眼睛，一下就看清象是啥樣了！
看了這個以後，再次喊打假前，好好想想吧！
Mike M. Mueckler和Paul W. Hruz 《Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter》的鏈接：
https://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/09687680110072140
下麵一起來看看我辛辛苦苦搞得highlights（注不是所有的文獻都列出了的）：
一級結構
一，一九八五年被克隆 (Mueckler et al. 1985).
二，86-89年小鼠，大鼠，兔子和豬的GLUT1的cDNA被克隆 (Birnbaum et al. 1986, Asano et al. 1988, Kaestner et al. 1989). 發現GLUT1的氨基酸序列在不同的種中高度保留。
三，一九八五年Mueckler第一次提出GLUT1有12個特征性的跨膜α-螺旋，其中N-和C-末端都在胞漿內的結構 (Mueckler et al. 1985).
四，一九九三年有人提出一個不同的模型 （Fisch- barg et al. 1993), 但12跨膜α-螺旋的模型經得起不同的試驗方法得到的資料考驗。
二級結構
五，一九八七年有人用光譜學方法測得放在脂質體中從紅細胞上分離出來的GLUT1的二級結構。發現
重構蛋白的傅裏葉變換紅外光譜顯示出主要在α-螺旋結構中發現的振動和拉伸頻率（Alvarezet al.，1987）。
六，一九八七年有人通過用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對純化的轉運蛋白進行蛋白水解處理獲得的GLUT1的膜內部分的光譜也顯示出α-螺旋結構（Cairns等人，1987）。
七， 一九八六年GLUT1上的偏振傅立葉變換紅外光譜重建成定向的多層脂質薄膜，確定12個跨膜α-螺旋排列幾乎垂直於膜，傾斜小於388（Chin et al.1986）。
八，一九八七有人通過對重構蛋白質的圓二色性數據獲得了對GLUT1的主要α-螺旋含量的進一步支持。這些研究估計GLUT1由82％α-螺旋，10％b-轉和8％無規卷曲結構組成（Chin等，1987）。
膜拓撲結構
12個跨膜螺旋的定向 細胞膜內的GLUT1已經通過幾種獨立技術得到驗證。已經通過蛋白水解切割和免疫表位作圖實驗證實了C末端的細胞質定向和連接TM區段6和7的大序列。
（原文的圖二，膜拓撲結構，顯示有這個大家族共有的12螺旋結構
九， 一九八七有人通過在紅細胞膜內的轉運蛋白從細胞質側暴露部分切割GLUT1產生分別對應於TM區段6±7環和c-末端內殘基213±269和457±492的肽片段（Cairns等人，1987）。
十，一九九零年有人發現針對C-末端和大的胞內區r環的單克隆抗體僅在暴露於細胞質那一麵時才能與轉運蛋白結合（Davies等，1990）。
十一， 連接TM區段1和2的環的細胞外位置也通過GLUT1的ASN45處的單糖基化位點建立。一九九一年有人通過突變研究證實GLUT1的糖基化隻發生在該位點上，該天冬酰胺殘基的擾動可讓所有糖基化的消除（Asano等人，1991）。
十二， 一九九三年有人用不滲透的生物素化試劑在完整細胞內標記Lys300證實連接TM區段7和8的環的在細胞外（Preston和Baldwin 1993）。
十三，一九九四年有人用不滲透的巰基定向試劑標記非洲爪蟾卵母細胞異源表達的GLUT1中的Cys429，這一結果也和與連接TM區段11和12的環位於細胞外的預測一致（Wellner等人，1994）。
十四，一九九四年有人用一種叫糖基化掃描突變術將每個跨膜螺旋之間的預測的鏈接都放上一個N-鏈接的糖基化序列最準確地得到了GLUT1的膜拓撲結構。
三級結構
Mueckler等在一九八五年提出GLUT1結構的原始模型（Mueckler等，1985）預測了由五個TM a-螺旋並列形成的中央水通道的形成（即3,5,7,10 和11），每個都具有一些兩親性。
十五，Jung等人利用氘交換所得到的數據支持這個中心水通道的存在，這些數據顯示 80％的GLUT1酰胺質子可被水性溶劑接近（Jung等人，1986）
十六，這個現象和GLUT1能促進水的轉運是一致的（Fischbarg等，1990）
十七，一九八七年有人就提出哺乳動物和細菌糖轉運蛋白是同源的。
十八，一九九三年Baldwin提出了包含兩個不同的6螺旋結構的假設螺旋包裝組合模型（Baldwin 1993）。
十九，在此基礎上，Gould和Holman於一九九三年構建了詳細的結構模型（Gould和Holman，1993）。
二十，Zeng和同事於一九九六年用GLUT1的分子模型考慮了水通道的大小，螺旋能量填充和宏觀極性以及環長度，提出了兩種可能的結構，其中螺旋排列成四束圖案（Zeng等，1996）。
二十一，與pCMBS修飾相結合的半胱氨酸掃描誘變技術為幾種TM殘基的溶劑可及性提供了實驗證據。在產生所有五種天然GLUT1結構185半胱氨酸已經突變為甘氨酸或丙氨酸的GLUT1分子後，這些實驗成為可能。一九九四年，Wellner等發現無半胱氨酸轉運蛋白保持接近野生型轉運活性，說明GLUT1對突變很有耐受力（Wellner等，1994）。
二十二，以後幾個研究組又相繼對12個TMα-螺旋中的5個（2,5,7,10和11）進行了半胱氨酸掃描突變研究（Hruz和Mueckler 1999,2000，Makepeace和Mueckler 1999，Olsowski等2000）（螺旋10）（未發表的作品，C。Makepeace和M. Mueckler）。和整個編碼序列已進行半胱氨酸掃描誘變大腸杆菌遠緣相關的乳糖通透酶轉運蛋白中觀察到的結果類似（Frillingos等，1998），這些GLUT螺旋中的很少有半胱氨酸殘基出現對運輸活動至關重要。到2009該文截稿時，GLUT1中的106個半胱氨酸突變體中超過80％保留了大於50％的完全沒有半胱氨酸的GLUT1的 2-DOG攝取活性。 五個螺旋所有的敏感殘基都在細胞外麵。根據這些結果，該綜述的作者又提出了圖上的一個各個螺旋如果排列的工作模型，並指出為了確立各個螺旋之間的距離還有很多工作要做。
（原文圖三；盲人摸象之三級結構，其中中間那比較關鍵的五個螺旋當時已經有人做個多個突變試驗，模型就是在此基礎上連猜帶蒙搞出來的，作者承認還有很多工作要做，謙虛！）
這裏引用的 Frillingos等，小Yan也有引用，說明這個蛋白可能研究的比較透徹。或者相關性比較好。
瓶口（葡萄糖結合的地方）
下圖是當時作者的瓶口模型，具體講有五個螺旋組成了瓶口，並顯示葡萄糖如果和瓶口上的各個部位通過氫鍵鏈接。這裏引用的工作有：
二十三，早在一九七三年，該基因還沒有克隆的時候，就有人已經通過研究各種在不同羥基被取代的葡萄糖類似物抑製運輸活動的能力來研究與紅細胞膜內的GLUT1分子中決定和葡萄糖結合的因素（Barnett et al.1973）
二十四，當時正在進行的螺旋-10的半胱氨酸掃描突變表明Glu-380確實可以被含水溶劑接近，在該位置突變導致運輸活性顯著降低（C. Makepeace和M. Mueckler，未發表的工作）
（原文圖三；盲人摸象之瓶頸 - 原文沒有稱之為瓶頸，顯示葡萄糖如何在入口處和該運載體結合，作者依然承認還有很多工作要做，再謙虛！）
四元結構
文裏具體談了一些試驗資料證明GLUT1可能以單體，二聚體或者四聚體存在的證據或者可能性。
二十五，單體就有活性的資料 (Baldwin et al. 1981, Burant and Bell 1992).(Jarvis et al. 1986). (Pessino et al. 1991). (Lundahl et al. 1991).
二十六，支持以二聚體(Jacobs et al. 1987) 或者四聚體存在的證據 （(Hebert and Carruthers 1992).
文章的結論（Conclusion）之一：
"雖然目前的關於GLUT1的結構/功能關係，包括圖中（原文圖三）顯示的GLUT蛋白三級結構的模型的研究工作讓人有很不錯的印象，但所有的知識體係都仍然是推測性的。結構的最終確認必須等待技術進步，這些技術包括能讓“促進轉運蛋白”結晶和/或能純化足夠的功能蛋白用以在溶液狀態進行結構分析。"
“皮特（我老板Peter Maloney先生的名字）在打字，看到我喘不上來氣一樣，不知怎麽回事，當即問：“潤濤，發生了什麽？”我一邊喘氣一邊抹汗，然後把兩胳膊合在一起，再把兩手分開成喇叭口狀。然後把兩手的手指尖合在一起，手臂張開。反複重複這動作給他看。皮特看到我不說話而是胡亂比劃，害怕我被將近三年搞出來了個無結果的結局給氣瘋搞成癲癇了，便仔細盯著我看。我跑到外邊的實驗室，拿兩把板尺，都是一尺長，不用我的身體表演給他，而是用兩把尺子繼續表演喇叭口朝外轉變成喇叭口朝裏。他突然間明白了，我不是氣瘋了，而是在表演我的結果－－葡萄糖載體的工作機理模型。
“葡萄糖載體蛋白的工作機理是這樣的？”他驚喜地問。
六幾年開始有人提出喇叭口，學術上用alternating access model. 但內含逐年增加。老閻九三年描述自己,好象不知道有喇叭口模型。Peter不看具體詳細結果，憑老閻兩手比劃，也同意了喇叭囗機理。 由此，很多人認為老閻是畫喇叭口第一人。
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