笑鬆：漫漫求索路 一一 征服肝炎病毒的艱難曆程（一）
有一種病毒引起的傳染病累及10%的中國人，從嬰兒到老人都不能幸免。感染的人數冠於全球，被稱為“中國第一病”，這就是乙型肝炎。
能引起肝炎的病毒有甲、乙、丙、丁、戊五型。各型病毒感染後的急性期症狀大同小異。最明顯的症狀是黃疸，即皮膚、鞏膜呈現黃色，尿液顏色轉深。但黃疸並不出現在所有病人身上。此外還有疲倦、厭食、上腹疼痛等等。這些肝炎病毒傳染的途徑和預後不同。甲型和戊型通過糞-口途徑傳染，感染後潛伏期和病程較短，預後良好，絕大多數患者能自行痊愈，病毒被清除，不會轉變成慢性感染。乙型和丙型通過血液和身體的密切接觸傳染，潛伏期較長。丙型肝炎病毒感染後絕大多數發展為慢性，患者終身攜帶病毒。乙型肝炎的預後則視感染時的年齡而定。攜帶乙肝病毒的產婦在分娩過程中可通過其血液將病毒傳給新生兒，使之成為終身病毒攜帶者，多數沒有臨床症狀，但可將病毒傳給他人。成年人被乙肝病毒感染，發生急性肝炎後，大多數人能將病毒清除，隻有10%轉變為慢性。丁型肝炎病毒是一種不完全的病毒，通過血液傳染，但隻能感染乙肝病毒攜帶者。
五種肝炎中最常見的是甲、乙、丙三型，危害最大的則是乙型和丙型，因為慢性乙型和丙型肝炎有可能誘發肝硬化，乃至肝癌，嚴重影響患者的健康和生命。這些肝炎病毒的發現以及相關疫苗和治療藥物的開發，堪稱120多年的病毒學史上曆時最長，過程最為艱巨曲折，而且至今尚未結束的探索。
發現篇
與艾滋病等20世紀以來的新現傳染病不同，肝炎是一種古老的疾病。西亞兩河流域地區四千多年前的古巴比倫泥板上的醫學典籍，以及兩千多年前中國的《黃帝內經》，都記載了肝炎的主要症狀——黃疸。清代沈金鼇編撰於1773年的《沈氏尊生書》中有“黃疸”一節，描述了黃疸病的傳染性和嚴重性。19世紀到20世紀初，黃疸病肆虐於歐美各國。美國南北戰爭時期（1861 – 1865年）的南北兩軍都有大量的黃疸病人，僅北軍的醫務部門正式記錄在案的黃疸病人就有87236例。第一次世界大戰期間（1914 – 1918年），各交戰國的前線參戰部隊以及後方都市平民中都曾有多次黃疸病的爆發流行。當時的主流醫學界錯誤地認為黃疸的起因是腸粘膜的病變。直到病理學家解剖檢查了有黃疸的死亡士兵屍體，才注意到肝髒的病變。1930年代，兩名丹麥醫生使用中空針頭成功取得肝髒活檢標本，由此確立了黃疸是由肝髒的炎症引起的。不過當時對於肝炎的病原體和傳播方式還一無所知。
19世紀末到20世紀上半葉見證了現代醫學的快速發展。注射器的發明和藥物針劑、輸血和血液製品，以及各類疫苗的開發和推廣使用，拯救了無數的生命。與此同時，醫學界也注意到這些治療和預防措施有時能導致肝炎。病人接受輸血後發生的肝炎成為臨床上一個棘手的難題。除此之外，當時的一些疫苗產品，例如黃熱病疫苗，含有人血清作為穩定劑。黃熱病是一種通過蚊蟲叮咬傳播的病毒性傳染病，主要流行於非洲及中南美洲的熱帶地區。1942年，美國軍方決定給所有將被部署到海外黃熱病疫區的部隊接種黃熱病疫苗，結果總共誘發了五萬例急性肝炎。僅路易斯安那州的波爾克軍營一處，同一天內曾經給五千名士兵接種了疫苗，其中一千人隨後出現黃疸。
種種跡象表明，肝炎有可能通過血液、血液製品、或者未經徹底消毒即重複使用的注射器傳染，於是通過這些途徑傳染的肝炎就被稱為“血清性肝炎”，以區分於先前所知的“傳染性肝炎”。由於這些肝炎的病原體仍屬未知，也就無從鑒別出帶有傳染性的供血者和血液樣品。尋找肝炎病原體已經成為刻不容緩的緊急任務了。
1892年，俄國植物學家伊凡諾夫斯基（Dmitri Ivanovskii）發現了第一種比細菌還小，可以通過特殊的陶瓷濾器的生物——煙草花葉病病毒。20世紀初，醫學研究人員已經可以從不同疾病患者身上取得各種標本（例如血液或鼻咽灌洗液），濾除細菌，然後接種到實驗動物身上，複製出病人的臨床症狀，從而確定人類的一係列傳染病是由病毒引起的，包括狂犬病、脊髓灰質炎（小兒麻痹症）、流感，等等。到了1930年代，研究人員進一步發現流感等疾病的病毒可以在雞胚（即孵化過程中的受精雞蛋）中繁殖擴增，大量產生。直到今天，每年用來製造流感疫苗的病毒主要還是用這種方法生產的。然而這一切研究手段對於肝炎病原體的鑒別，都沒有起到任何作用，尤其是還沒有找到一種合適的動物，可以作為肝炎的疾病模型。於是研究人員想到了直接用人體來進行肝炎接種實驗。
二次大戰期間，美國軍隊受到肝炎流行造成部隊減員的嚴重影響。為了尋求控製肝炎流行的方法，軍方開始利用誌願受試者來進行肝炎接種實驗。所招募的受試者有些是在監獄服刑的囚犯，有些是出於個人信仰，拒服兵役的征兵對象，或者拒絕執行戰鬥任務的士兵。根據戰時法律，這些人可以通過選擇到某些非戰鬥性崗位服務，或者充任醫學實驗的受試者，來換取免遭刑罰。為了確定肝炎的傳染方式，軍方研究人員從肝炎患者取得糞便、血清、鼻咽灌洗液和尿液，經處理後通過不同途徑接種到實驗對象身上，然後觀察他們發病的情況。
到了1950年代中期，美國紐約大學醫學院的兒科醫生克魯格曼（Saul Krugman）在紐約州的柳溪學校以集中收養的智障兒童為實驗對象，進一步用肝炎患者的糞便抽提物和血清進行了一係列的接種實驗，曆時十餘年，先後有700多名智障兒童被作為受試者。
以上這些人體實驗的結果清楚地表明，“傳染性肝炎”和“血清性肝炎”都是由病毒引起的，前者通過糞-口途徑傳染，後者通過血液傳染。這兩種肝炎痊愈後患者血液中都出現抗體，能保護康複病人，防止他們再次罹患同一種肝炎。但是所得到的免疫力沒有交叉保護作用，表明兩種肝炎的病原體是截然不同的兩種病毒，亦即後來發現的甲型和乙型肝炎病毒。
這些人體接種實驗，尤其是克魯格曼的智障兒童肝炎接種實驗，明顯有悖於當今社會普遍接受的人類醫學研究的倫理準則；但在當時的曆史條件下，這些實驗為甲型和乙型肝炎病毒的最終發現以及疫苗的開發作出了重要的貢獻，也是不爭的事實（參閱： 笑鬆：人道乎，不人道乎？——談談人體醫學實驗的倫理問題。http://hx.cnd.org/?p=168197）。
肝炎接種實驗雖然證明了兩種肝炎病毒的存在，卻沒有揭示這些病毒的廬山真麵目。這就像在一座城市中發生了一係列刑事案件，警察通過調查確認了這些罪案分別是兩名罪犯所為，但罪犯的身份卻還沒有確定，自然也就談不上將他們逮捕歸案，消除治安隱患。這一目標的最終實現，首先應歸功於美國遺傳學家布倫堡（Baruch Blumberg）。可是他直到自己鍥而不舍的努力的最後階段，才意識到所做的工作與肝炎有如此重大的關係。
1960年代，正當克魯格曼醫生在柳溪學校忙於他的肝炎接種實驗時，布倫堡博士熱衷於研究的是與之風馬牛不相及的另一個問題：遺傳因素造成的不同人種的血清中所含蛋白質成分的差異。
布倫堡對這個問題的興趣，始於他在哥倫比亞大學醫學院的學生時代。三年級過後的暑假，他參加了一位教授指導的研究課題。教授是個寄生蟲病專家，派他出差到南美州蘇裏南的一個偏遠礦區工作了幾個月，因為那裏流行一種由血絲蟲感染引起的疾病，稱為象皮病。當地居民的族裔成分十分複雜，包括印尼裔、華裔、非裔、印度裔、猶太裔，等等。布倫堡注意到，不同族裔對血絲蟲病的易感程度差別很大。
當時醫學界已經知道人類不同個體的某些蛋白質在大小、形狀上可以不完全相同，使得其功能也略有差異。這就是蛋白質的多態性。布倫堡猜測，由遺傳因素決定的蛋白質多態性可以影響對血絲蟲病，以及其他疾病的易感率。從醫學院畢業以後，他先後在美國和英國的幾個機構繼續這項研究，為此旅行到世界各地，從不同族裔人群中采集了大量的血清樣品，仔細地分析比較。他發現由於血清蛋白質成分的差異，人體在接受輸血後，有可能產生針對來自供血者的異種蛋白質（異種抗原）的抗體。在那些為了治療某些疾病，例如血友病，需要經常接受輸血的病人中，產生這類抗體的機會特別高。這些病人的血清就被布倫堡作為工具，用來識別不同個體之間血清蛋白質的差異成分。
1964年，布倫堡加入了美國費城的一家癌症研究所，與美國國立衛生研究院（NIH）一位年輕的研究人員阿爾特（Harvey Alter）合作進行研究。他們利用紐約市一名血友病患者的血清中所含的抗體，發現在一名澳大利亞土著居民的血清中，有一種前所未知的新抗原。這個新抗原被命名為澳大利亞抗原，簡稱澳抗。進一步的分析發現，澳抗在美國的一般人群中比例很低，唯獨在白血病患者中的比例很高。
為了解釋這一現象，布倫堡提出一個假設：有一種遺傳因素，即基因，使人一方麵帶有澳抗，另一方麵容易罹患白血病。如果這一假設是正確的，那麽在白血病的高危人群（即特別容易患白血病的一群人）中，澳抗陽性的比例也應該較高。唐氏綜合症是一種由於染色體異常引起的先天性疾病。當時的醫學界已經知道，唐氏症兒童患白血病的幾率高出正常兒童二十倍以上。於是布倫堡也將注意力投向一家智障兒童收養院中的唐氏症患兒。結果發現，這些孩子的澳抗陽性率果然高達30%，而且血清中澳抗的有無似乎是穩定不變的（由遺傳基因決定的性狀當然應該是這樣）。這些初步觀察結果與他的假設顯得十分一致。
然而隨著檢測範圍的擴大，布倫堡發現，澳抗並不僅僅存在於白血病的高危人群，而是在多種不同的病人群體中都能檢出。他還發現澳抗在亞洲、非洲、大洋洲的居民中很普遍，陽性率約為10%。看來澳抗與白血病關係的假設是站不住腳的。
就在這時，兩個偶然發現的肝炎病例，將布倫堡的研究引向一個全新的方向。布倫堡的實驗室中有個女技術員，擅長從澳抗陽性的血清中提取純化的澳抗樣品，用於各種實驗。她經常用自己的血清作為澳抗陰性的實驗對照。有一天她感覺不適，而且出現黃疸症狀。當她再次采集自己的血清來測定澳抗時，發現已轉為陽性。另外一個病例是澳抗陰性的唐氏症患者。在被追蹤研究期間得了肝炎，伴隨著肝炎症狀的出現，澳抗由陰轉陽。布倫堡於是恍然大悟，將澳抗與肝炎聯係起來（1）。
與此同時，紐約血液中心有個研究人員名叫普林斯（Alfred Prince），也利用來自一名接受過多次輸血治療的血友病人的血清抗體，在一批輸血後肝炎患者的血液中找到一種與肝炎密切相關的新抗原。普林斯將它命名為“血清性肝炎抗原”，在 1968年7月發表了這個結果（2）。一個月後，他又在《柳葉刀》發表了一篇短通訊，報告他通過比較自己所用的抗體與布倫堡所用的澳抗抗體，發現“血清性肝炎抗原”其實就是已知的澳抗（3）。
布倫堡博士無心插柳柳成蔭，從一個遺傳學家，病毒學的門外漢，一個華麗轉身成為公認的肝炎病毒研究的先驅， 並因此榮獲1976年的諾貝爾醫學獎。獲獎理由是他“發現了澳大利亞抗原，並且證明它與……血清性肝炎的聯係”(4)（盡管有人認為普林斯對證明這一聯係的貢獻比布倫堡更大）。他的故事生動地顯示了科學研究的基本方法：從觀察的現象出發，提出假設，進行實驗，根據結果修正原先的假設，再進行新的實驗，如此往複循環，逐步形成正確的理論。布倫堡最初認為澳抗與白血病受同一種遺傳因素控製，這個假設顯然是錯誤的（其實是白血病人由於治療需要經常接受輸血，因此受乙型肝炎病毒感染的機會大增），但這並不妨礙一個優秀的科學家通過周密的實驗和細致的分析，最終洞察真理。這樣的事例在科學史上是屢見不鮮的。
緊隨著布倫堡和普林斯的發現，哥倫比亞大學醫學院的教授戈克（David Gocke）帶領兩名學生格林堡（Harry Greenberg）和卡維（Neil Kavey）進行了一項重要的研究。他們將紐約市一家醫院血庫所保存的，已被用於輸血的2211份血液樣品逐一測定澳抗，鑒定出一批陽性血樣和陰性血樣，然後追蹤研究接受了這些血液的病人，了解他們輸血後是否發生了肝炎。格林堡的任務之一，就是開著戈克教授借給他的一部紅色敞篷跑車，跑遍紐約市的大街小巷，去尋訪那些輸血病人。幾十年後，格林堡回憶道：“敲開門一看，主人一臉蠟黃，我就想，又找到了一個！”
師生三人聯手努力，發現在12名接受了澳抗陽性血液的輸血病人中，有9人發生輸血後肝炎，其中7人是澳抗陽性；而在69名接受了澳抗陰性血液的輸血病人中，隻有4例輸血後肝炎。這個結果於1969年在《柳葉刀》發表（5）。它第一次表明，澳抗極有可能是具有乙型肝炎傳染性的血液所含的一種標誌性蛋白質。這項工作也成為格林堡成果累累的病毒學研究生涯的發端。
盡管此時澳抗的本質還不為人了解，阿爾特已經敏銳地意識到，對供血者普遍進行澳抗的篩選，將有助於避免輸血後肝炎的發生，並開始為此發聲呼籲（6）。
澳抗究竟是乙型肝炎的病原體，還是人體患乙型肝炎後產生的一種蛋白質？換句話說，澳抗是乙型肝炎的原因，還是肝炎造成的結果？布倫堡堅信前者是正確的答案，但他沒有可靠的證據。要回答這個問題，最直接的方法自然是將乙肝患者血液中的澳抗分離出來，接種到合適的宿主中，看看是否能引起乙型肝炎。可是此時克魯格曼的肝炎接種實驗已經遭到越來越強烈的批評，難以再進行類似的人體實驗。而除了人類之外，當時又不知道是否有任何動物可以感染乙型肝炎，供人進行實驗。
1970年，英國病毒學家丹恩（David Dane）利用一項新問世的電子顯微鏡技術，把澳抗的研究又推進一步。當一個抗原分子遇到它的特異性抗體分子時，二者相互結合，形成所謂的抗原-抗體免疫複合物。抗體分子的形狀類似於大寫字母Y，字母分叉的兩個頂端各有一個抗原結合位點，可以分別結合一個抗原分子。電子顯微鏡的放大倍數遠遠超過光學顯微鏡，後者隻能看到細菌，前者可以看到病毒，但還不足以看到比病毒更小得多的單個抗原或者抗體分子。可是如果抗原分子是由某種尺寸較大的結構（例如病毒顆粒）所攜帶，而且每個顆粒上帶有多個抗原分子，那麽當抗原和抗體以一定的比例相混合時，單個的抗原顆粒就會被抗體分子通過它的兩個結合位點拉攏到一起，在電子顯微鏡下看到的將是大量顆粒的聚集體；如果不加抗體，看到的則隻是分散的單個顆粒。這就是所謂免疫電鏡術，它使得研究人員可以清楚地看到並且鑒別帶有某種特殊抗原的病毒顆粒。
丹恩將一名澳抗陽性的肝炎病人血清樣品與澳抗抗體混合後，果然在電鏡下看到了大量聚集在一起的球狀顆粒，顆粒直徑約為20納米。這會不會就是顯露原形的乙型肝炎病毒呢？且慢，除了這些20納米的顆粒之外，他還看到了另一種大得多的顆粒，直徑為42納米，但是數量少得多，隻有前者的三千分之一，被稱為丹氏顆粒（7）。在電鏡下，丹氏顆粒有一個清晰可見的核心。另一位英國病毒學家阿爾梅達（June Almeida）用去汙劑處理丹氏顆粒，除去它的外層，就得到直徑為27納米的核心顆粒，並且通過免疫電鏡術發現核心顆粒的抗原成分不同於澳抗（8）。至此，有關澳抗的圖像終於清晰起來：丹氏顆粒包含兩層蛋白質結構，外殼由澳抗組成，核心是另一種蛋白質，稱為核心抗原。病人感染乙型肝炎後，血液中都會出現針對這一核心成分的抗體，而且在肝炎痊愈以後抗體並不消失。於是丹氏顆粒的核心抗原就被稱為乙型肝炎核心抗原。澳抗則被正式命名為乙型肝炎表麵抗原，它在血液中隨著肝炎的發生而出現，肝炎痊愈後則消失。
丹氏顆粒的這種雙層結構與當時已知的一些其他病毒類似，這一點強烈地提示丹氏顆粒是引起乙型肝炎的病毒，感染肝髒細胞後，由於某種原因，病毒複製產生的表麵抗原蛋白質分子大大多於包裝新合成的病毒核心顆粒所需要的數量，多餘的表麵抗原分子就形成不帶核心的20納米顆粒，釋放到血液中。不過病毒顆粒除了蛋白質的核心和外殼，還應該含有一個攜帶遺傳信息的關鍵成分，就是核酸，它可以是DNA，或者RNA。隻有找到這些核酸，才能確認丹氏顆粒是完整的病毒顆粒。可是丹氏顆粒在病人血清中的含量很低，又無法在實驗動物或體外培養的細胞中大量擴增，以1970年代初的技術水平，要想依靠傳統的生物化學手段，從丹氏顆粒中分離出它的核酸成分來直接進行研究，談何容易。
直接的手段行不通，研究人員轉而求諸間接的策略：首先尋找病毒核酸複製所需要的酶。通過這個途徑取得重要突破的，是斯坦福大學的病毒學家羅賓遜 （William Robinson）。1973年，羅賓遜教授發現丹氏顆粒內帶有病毒的DNA聚合酶；一年以後，又發現了這種酶合成的產物——病毒DNA。這一發現的過程揭示了乙型肝炎病毒一個很特別的性質：在被感染的肝細胞內完成複製及包裝後釋放到血液中的丹氏顆粒，所含有的病毒DNA並不是完整的雙鏈分子，而是帶有部分的單鏈。用離心機將肝炎病人的血清以高速旋轉，使病毒顆粒沉澱到離心管底部，回收後置於試管中，隻需要加入合成DNA所需的小分子原料，丹氏顆粒中的病毒DNA聚合酶就會以DNA上的單鏈部分為模板，合成完整的雙鏈病毒DNA。所加入的原料分子帶有放射性同位素的標記，使得合成的雙鏈DNA分子能夠以極高的靈敏度被探測到（9）。這一結果不僅證明了乙肝病毒DNA的存在，而且可以通過測定新合成的雙鏈DNA產物的放射性強度，來估計血清中丹氏顆粒的承載量。在DNA聚合酶鏈式反應（PCR）技術發明之前，這個方法在乙肝病毒研究中發揮了重要作用。
乙型肝炎病毒完整圖像的拚圖板塊，就這樣一片一片地落到正確的位置上。但是羅賓遜教授堅持認為，要確認這個病毒就是乙型肝炎的病原體，還需要證明他得到的病毒DNA的確承載著肝炎病毒的遺傳信息，可以指導合成病毒顆粒的所有蛋白質組分，使它們能裝配成有傳染性的乙型肝炎病毒。可是他能得到的病毒DNA數量實在有限，不足以用來進行這些研究。怎樣才能實現這個目標？
（待續）
